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网址:www.yeasen.com 第1页,共3页HB180824 Protein A/G Agarose Resin 蛋白 A/G 琼脂糖纯化树脂 产品信息 产品名称 产品编号 规格 储存 Protein A/G Agarose Resin 蛋白 A/G 琼脂糖纯化树脂 36403ES03 1ml 4℃ Protein A/G Agarose Resin 蛋白 A/G 琼脂糖纯化树脂 36403ES05 2ml 4℃ Protein A/G Agarose Resin 蛋白 A/G 琼脂糖纯化树脂 36403ES08 5ml 4℃ Protein A/G Agarose Resin 蛋白 A/G 琼脂糖纯化树脂 36403ES25 25ml 4℃ Protein A/G Agarose Resin 蛋白 A/G 琼脂糖纯化树脂 36403ES60 100ml 4℃ 产品描述 天然蛋白 A(Protein A)是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白,天然蛋白 G(Protein G)是一种分离自 G 型或C型链球菌属的细胞表面蛋白,二者功能相似,主要通过与免疫球蛋白(Ig)的Fc 区相互作用,可结合大多数哺乳动物 的IgG. 然而两者结合特异性上有所不同 (详细见附录 1, 蛋白 A, G 对不同物种 Ig 的结合能力总表) , 如蛋白 G 对人 IgG3, 大鼠 IgG2a,绵羊 IgG1 具有很高的亲和力,但蛋白 A 对这些 Ig 结合力很弱.蛋白 A,蛋白 G 常共价偶联在固体载体如琼 脂糖珠或丙烯酸树脂小珠上,直接用以做免疫沉淀(IP)或者免疫共沉淀(Co-IP)来进行蛋白功能相关研究,或者直接装 在层析柱上来纯化单克隆或者多克隆抗体. 本品使用的是基因改造后的蛋白 A 和蛋白 G,不仅维持其本身的 Ig 亲和特性,同时也去除了天然蛋白本身的非主要结 合域以降低非特异性结合.本品同时将蛋白 A 和蛋白 G 共价偶联到琼脂糖凝胶微球表面,比单独的蛋白 A 或者蛋白 G 都有 更广的结合范围,适合于所有蛋白 A 琼脂糖珠和蛋白 G 琼脂糖珠单独可以结合的 Ig,实用性更高. 产品性质 基质(Matrix) 高度交联的 4%琼脂糖微球 配体(Ligand) 重组蛋白 A/G 孔径(Bead size) 45-165? m 最大流速(Flowmax) 0.1MPa, 1bar 储存缓冲液(Buffer) 含20%乙醇的 1* PBS 载量(Capacity) 约20mg human IgG/ml 基质 pH 范围(pH range) 3-10 运输与保存方法 冰袋运输.4℃保存,2 年有效. 需准备试剂 【注】 :建议以下缓冲液在使用前用 0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤. 结合/洗杂缓冲液:0.15M NaCl, 20mM Na2HPO4, pH7.0 洗脱缓冲液:0.1M 甘氨酸,pH 3.0 中和液:1M Tris-HCl,pH 8.5 交联缓冲液:0.2M 三乙醇胺,pH8.2 终止液:50mM Tris-HCl,pH 7.5 上海翊圣生物科技有限公司 客服热线:4006-111-883 E-mail: [email protected]

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网址:www.yeasen.com 第2页,共3页使用方法

一、免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP):

1 蛋白样品的准备: ① 贴壁细胞:取10 cm 细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS 洗涤

2 次,然后加入

500 ? l 至2ml 细胞裂解液裂 解细胞(如RIPA 裂解液) ;

② 悬浮细胞:离心收集细胞后,PBS 洗涤

1 次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解;

③ 动植物组织样本:参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解;

【注意】 :a)具体的裂解方法,应参考不同裂解液的详细使用方法;

b)不同量的细胞,应选用适当裂解液的用量进行裂解 (如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或 PBS 适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适 当减少裂解液的用量) ,通常裂解液最终总蛋白浓度选择在 0.5-1ug/ul 范围内较合适;

c)可选:细胞或组织处理时加入广谱 核酸酶 Benzonase(Yeasen Cat#20125) ,能够降解所有形式的 DNA 和RNA(单链、双链、线形和环状),而无蛋白水解活性. 此步操作可以降低背景,保障实验的可重复性.

2 去除非特应性结合(可选) : ① 取0.2-1 ml 细胞或组织裂解液, 蛋白量约为 0.2-1 mg, 加入约

1 ? g 和免疫沉淀时使用的 IgG 种属相同的普通 IgG 和20 ? l 充分重悬的 Protein A/G Agarose Resin,4℃缓慢摇动

30 min~2 h. ②

2500 rpm(约1000g)离心 5min,取上清用于后续的免疫沉淀. 【注】 : 所谓种属相同的IgG是指与后续免疫沉淀用一抗宿主相同的正常 IgG. 此步骤可以预先去除样本与 Protein A/G Agarose Resin 的非特异性结合,降低背景.

3 免疫沉淀: 1)抗体吸附 ① 取适量 Protein A/G Agarose Resin 加入到 2ml 离心管中,500rpm 离心 1min,吸弃上清. ② 加入 0.5ml 结合缓冲液重悬树脂,500rpm 离心 1min,吸弃上清.继续重复

2 次此操作. ③ 向上述已平衡树脂中加入抗体溶液,重悬树脂,室温下轻轻翻转离心管或置于翻转混合仪混匀 30min 后,500rpm 离心 1min,收集上清液,备用,待检测. ④ 向上述树脂中加入 0.5ml 的洗杂缓冲液,重悬树脂对其进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,500rpm 离心 1min,吸弃 上清.再重复

2 次. 2)抗体交联(可选) 【注】 :如需将抗体和目标抗原复合物共同洗脱,请忽略此步骤. ① 向清洗过的树脂中加入 1ml 交联 Buffer,500rpm 离心 1min,吸弃上清. ② 再向其中加入 1ml 20mM DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)的交联 Buffer,该试剂需现配现用,重悬树脂,室温 下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转,促使 Buffer 和树脂充分接触,30min 后,500rpm 离心 1min,吸弃上清. ③ 再向其中加入 1ml 终止液,重悬树脂,终止交联反应,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转 15min,500rpm 离心 1min,吸弃上清. ④ 加入 0.5ml 洗杂缓冲液,重悬树脂,进行清洗,500rpm 离心 1min,吸弃上清.再重复

2 次. 3)沉淀反应 ① 抗原吸附:向上述树脂-抗体溶液中加入含抗原的样品,用移液器轻轻吹打使抗原与树脂-抗体复合物分散均匀,室温下 手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转 10min,使抗原与抗体充分结合,如结合力较弱则可在室温下反应 1h 或者在 4℃ 下反应过夜. ② 洗杂:将上述完成抗原吸附的产物 500rpm 离心 1min,收集上清液置于冰上待检测.向离心管中加入 1ml 洗杂缓冲液, 用移液器轻轻吹打使树脂-抗体-抗原复合物分散均匀,500rpm 离心 1min,弃上清.重复

2 次,最后加入 1ml 洗杂液,将树 脂-抗体-抗原复合物转移至新的离心管中,500rpm 离心 1min,吸弃上清.

4 样品洗脱 【注】 :根据后续检测的不同提供两种洗脱方法. 1) 变性洗脱:该方法适于 SDS-PAGE 检测.向上述离心管中加入 25? l 1* SDS-PAGE loading buffer 混匀,95℃加热 5min. 500rpm 离心 1min,收集上清进行后续 WB 分析. 上海翊圣生物科技有限公司 客服热线:4006-111-883 E-mail: [email protected] 本产品仅作科研用途! 第3页,共3页2)非变性洗脱:该法洗脱的样品保持原有的生物活性,可用于后续功能分析.具体做法:向上述沉淀反应得到的树脂-抗体 -抗原复合物中加入5 倍体积的洗脱Buffer, 用移液器轻轻吹打数次, 室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转 10min, 500rpm 离心 1min,........