PPT《中南民族大学 药学院化学生物学教研室》

中南民族大学 药学院化学生物学教研室 尼龙固定化木瓜蛋白酶 化学生物学实验 1.

实验目的 化学生物学实验 6学时

1 2 学习尼龙固定化木瓜蛋白酶的原理和方法. 掌握共价结合法固定化酶的原理和方法. 中南民族大学 药学院化学生物学教研室 2.实验原理 化学生物学实验 6学时

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3 4 酶不与产品混合,制品易于纯化. 在大多数情况下,可提高酶的稳定性. 提高酶的使用效率,降低生产成本. 利用固定化酶,工业上可以大批量、连续化生产 定义:通过物理或化学的方法,将水溶性的酶与水不溶性载 体结合,使酶固定在载体上,并在一定的空间范围内 进行催化反应的酶称为固定化酶. 固定化酶的优越性主要表现在: 2.实验原理 化学生物学实验 6学时 包埋法 共价键结合法 交联法 酶的固定化方法有: 吸附法(物理吸附、离子吸附)

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3 4 2.实验原理 化学生物学实验 6学时 本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法.尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后,产生游离的-NH2基,在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO基缩合,戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨基缩合,形成尼龙(载体)-戊二醛(交联剂)-酶,即尼龙固定化酶. ―[NH(CH2)6NHCO(CH2)4CO]n― HCl ~R-CH2-NH2 OHC-CH2-CH2-CH2-CHO ~R-CH2-N=CH-CH2-CH2-CH2-CHO 目标产物 3.实验材料、试剂及仪器 化学生物学实验 6学时 材料 (1)尼龙布(86或66),140目,剪成3 cm*3 cm大小的方块(2)吸水纸 仪器 (1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱及玻璃器皿 中南民族大学 药学院化学生物学教研室 3.实验材料、试剂及仪器 化学生物学实验 6学时 (1)18.6% CaCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65 mol/LHCl溶液 (4)0.2 mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5) (5)5%戊二醛溶:用0.2 mol/L,pH值8.5的硼酸缓冲液配制 (6)0.1 mol/L硼酸缓冲液(pH值7.8)7)1 mg/mL木瓜蛋白酶溶液 (8)0.1 mol/L磷酸缓冲液(含3% NaCl) (pH值7.2) (9)0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2) (10)激活剂:用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制,内含

20 mmol/L半胱氨酸、1 mmol/LEDTA的混合液. (11)1%酪蛋白溶液:用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制. (12)10%三氯乙酸(TCA)溶液. 主要试剂 4.实验步骤

1、固定化酶的制备 (1)每组取5块尼龙布洗净、晾干,浸入10 mL混合液(取1.86 mL 18.6%CaCl2溶液加入8.14 mL甲醇溶液中,注意要现配现用) 中10s左右,取出后用水冲洗 、干净,用吸水纸吸干. (2)尼龙布用3.65 mol/L HCl溶液在室温下水解45min,用蒸馏水 冲洗三次至pH中性. (3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20 min. (4)取出尼龙布,用0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH值7.2)反复洗涤, 洗去多余的戊二醛,吸干之后,立即用酶液(0.5~1 mg/mL)在4℃下固定3.5 h(酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8 mL). (5)从酶液中取出尼龙布(保留残余酶液作测定用),用0.5mol/LNaCl溶液(用0.1 mol/L,pH值7.2的磷酸缓冲液配制)洗去多余的酶蛋白,即为尼龙固定化酶. 化学生物学实验 6学时 4.实验步骤 化学生物学实验 6学时

2、酶活力测定(1)溶液酶活力测定:取0.2 mL酶液,加入2.3 mL激活剂,于37℃ 下预热10min,加入37℃预热的1%酪蛋白溶液mL, 准确反应10 min,然后加入10%三氯乙酸溶液1.5 mL终止 酶反应.对照管先加入10%三氯乙酸溶液,后加酪蛋白溶 液,其他与测定管相同,以8000 r/min的转速离心10 min或 过滤,取其上清液于波长280 nm处测定吸光度.在上述条 件下,每10 min增加0.001个吸光度为1个酶单位(U).(2)残留酶活力测定:方法同溶液酶活力测定.(3)固定化酶活力测定:取一块尼龙布固定化酶,加入2.5mL激 活剂,其余步骤与溶液酶测定相同. 4.实验步骤 化学生物学实验 6学时 表1 酶活力测定 试剂 溶液酶 固定化酶 残留酶 CK