PDF《Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel》

20 min. 4)用5倍体积 TBS 平衡凝胶柱,直至流出液达到中性 pH. 1.2 纯化 1)上样:在层析柱中加满蛋白裂解液,重复上样 2-3 次可以尽可能增加蛋白与凝胶结合量. 2)清洗:用10-20 倍柱体积的 TBS 清洗,以去除非特异结合的蛋白. 3)洗脱(可选以下

2 种方法之一) : A、酸洗脱:收集管中加入 15-25 μL

1 M Tris,pH 8.0,分别用

1 mL 0.1 M Gly-HCl,pH 3.5 洗脱,再重复

5 次. B、3* Flag 多肽(Cat 20571ES)洗脱:用TBS 配制 Flag 多肽溶液(100 μg/mL)洗脱,分别用

1 倍柱体积多肽溶液洗脱, 重复

4 次. 1.3 填料再生与保存 1)柱再生:使用后立即再生,用3倍柱体积 0.1 M Gly-HCl,pH3.5 清洗,立即用 TBS 平衡,直至达到中性 pH. 2)保存:用10 倍柱体积 TBS(含50%甘油,0.02%叠氮钠)清洗,再加入

5 mL 该溶液至柱中,保存在 2-8℃或-20℃中.

2 免疫沉淀(IP) 2.1 免疫沉淀(IP) 1)充分重悬 Anti-Flag 亲和纯化凝胶,尽量形成均一的溶液.取40 μL 混合液(20 μL gel)至新的离心管中. 2)5,000-8,200*g 离心

30 s,使凝胶沉淀在离心管底部,在加入样品前,静置 1-2 min.去除上清,此时要小心操作,避免吸 到凝胶. 3)加入

500 μL TBS,轻轻的重悬 Anti-Flag Affinity Gel,10,000 rpm 离心

30 s,弃上清,重复上述步骤

1 次. 4)可选步骤.为去除凝胶中痕量的未结合抗体,可加入

500 μL 0.1 M glycine HCl,pH 3.5 清洗凝胶,离心去除上清,加入

3 倍体积 TBS,轻摇 2-3 分钟,5,000-8,200* g 离心

30 s,弃上清,重复洗涤至上清 pH 为中性.Glycine HCl 处理时间切 勿超过

20 min. 上海翊圣生物科技有限公司 客服热线:400-6111-883 E-mail: [email protected] 本产品仅作科研用途! 第3页,共3页5)加入 200-1000 μL 细胞裂解液,如有必要,可用裂解液调整至终体积

1 mL.细胞裂解液的体积取决于 Flag 融合蛋白的表 达量.阳性对照,需要加入

1 mL TBS 和4μL

50 ng/μL Flag-BAP 融合蛋白(约200 ng) ;

阴性对照,只要加入

1 mL 裂解 缓冲液即可(不含蛋白) . 6)4℃缓慢孵育

2 小时.如需提高结合效率,可延长至过夜. 7)5,000-8,200*g 离心

30 s,去除上清. 8)上述沉淀用 0.5 mL TBS,轻摇混匀,5,000-8,200* g 离心

30 s 去尽上清,重复

3 次. 2.2 Flag 融合蛋白洗脱(可选以下

3 种方法之一) 1)非变性洗脱(3* Flag 多肽) a. 配制 3* Flag 多肽洗脱液:用0.5 M Tris-HCl 溶液,pH 7.5(含1M NaCl)溶解 3* Flag 多肽,终浓度为

25 μg/μL.用ddH2O 稀释至

5 μg/μL,加入

3 μL

5 μg/μL 的3* Flag 多肽,加入到

100 μL TBS 中(终浓度

150 ng/μL) . b. 分别加入

100 μL 3*Flag 多肽洗脱液,4℃孵育

30 min(慢慢摇晃) ,5,000-8,200*g 离心

30 s,转移上清至新管中(不要吸 到凝胶) .如立即使用,上清可保存在 4℃,-20℃长期保存. 2)酸性洗脱(0.1 M Gly-HCl,pH 3.........