PDF《中国病毒学》

1 1 毒株、茁株 与载体犬细小 病毒病犬 酾溶 物由内蒙古农业大学兽医系布曰占德 老师提供,由本 室分离鉴定.菌株E. DH S a由本 室保 存 .质 粒载 体pUC

1 9购 自北 京华美生物 工程公司.12主要试剂Ta qD NA聚 合酶 、 B a r nH I 、 s 瞳fI、B鲁I

1、 T

4 DNA连接酶、X―gal、IPTG 及~.DNA / 胁nd Ⅲ ma r k e r等均购自北京华美 生物工程 公司.13引物设计与合 成根据国外报 道的CPV美国1株 ( C PV. N) 和美 国 2株 ( CP V B ) 基 因组 全 序列 _

3 , 设计合成 一对特异性引物.为了便 于基 因操 作,引物1和 引物 2的5端分别引入 了BarnHI 和Sal限制 性酶切位点.Prime r 1(

2 6 m ) :5 C C G GA TC C A GA GA C AAT C TTG C AC CA

3 ( + ) , P r i me r

2 (

2 6 n l e r ) ;

5 C G C GA GC T CTA TA TC A AA TA CA AGTA

3 ( 一) . 引物 由上海 生工生物工 程有限公司台 成.14病毒提纯 与鉴定取病犬肠 溶物25mL 组织匀浆器充 分 研磨 , 加入2倍 体积 P B S和1/5体 积 氯仿 . 冰浴乳化30mn.i0000r,mi n离心30r ai n , 上清中加入

1 0 %聚 乙二 醇(60

0 0 ) , 充分溶 解后 置4℃ 静置 过夜.8

0 0

0 r / mi n离心30mi n 取沉淀.沉淀回溶 于5mI P R S井充分研 睹.5000r/rai n离心15mi n取 上清 , 上清液经38000r/rai n离心2h.沉淀回溶 于1ml

1 0倍 稀释 的Picks中.

2 %P TA 负染 , 电镜 观 察病 毒形态.病毒鉴定采 用猪红细 胞凝集试验 和酶联免疫 吸附测定.

1 .

5 病毒DNA提取采用 S D S - 酚.氰仿抽提 法_6J,从提纯 的犬 细 小病 毒中 提取 基 固组 DNA, 琼脂糖凝胶 电泳 检测DNA大小.1.6pc R扩增以提 纯的CP V DNA为模板,加入 P C R缓}中液 、 特异性引物1和 引物

2、dNTP、 Ta q DNA 聚合酶.石蜡油覆盖.于94℃ 1mi n ,

5 0℃ 2mi n ,7 2℃ 3r ai n . 扩增

3 0个循环,于72℃ 延伸lOmi n . 取10LPCR产物用1%琼 脂 糖凝 胶 电泳检 测.1.7克隆与 序 列分 析PCR产物 的 克隆 按 常规 方法_6J.用 踟HI和s瞳c1分别消化pUCI 9质粒和经酚、氯仿抽提后的PCR产物,低熔点琼 脂糖 凝肢回收所需 片段 , 连接井转化EcDH

5 ~ ~ , 提取重组质粒,经PCR及 酶Ⅵ法鉴定削 性克隆.重 组质粒交由大 连宝生物 工程公司测 序.对已测 序的 CP V. I M 株与 国外其它 C P V 分离株及FPIV进行棱苷酸 和氨基酸序列比较 .

2 结果2.1病毒的提 纯 与鉴 定以自然 感染的病犬肠溶物上清液为材料,经研磨乳化,l0%聚乙二醇沉淀和差速离心法提纯犬细小病 毒 .经 P TA染色、电子 显微 镜 观察 , 获得 了直径

2 5 n m 的球 状病毒(图1).血 凝 试验 和EL I S A结 果均 表 明该 球状病 毒为 犬细小病 毒.2.2PCR产物 的获得 从提纯 的犬细 小病 毒 中提 取基 因组 D NA, 以此 D NA 为模 板,加入人工 合成 的 引物 1和引物2进 行PCR扩 增,琼脂 糖凝胶 电泳结 果表 明:获得 了1_88kb的特异性 条带 ( 图2)维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 董江 丽等 : 犬细小病毒中国内蒙 株VP 2基因克隆 及序列分析 图l提纯的犬细小儡毒(x4I】【I『l【I)Fi g

1 Pu r i f i e d Ca n i ne P… … (*4t } <

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2 3 阳性克隆 的鉴 定将扩增得到的CPVvP

2 区188kb的片段,插入pUC1

9 质粒的多克隆位点BamHI 和SacI之 间,获得的重组质粒用PCR鉴 定,琼脂 糖凝胶电泳 结果表明:得到了预 期的I,88kb的 条带 ( 图2).限制酶切 分封 千表明: 该 阳性 克隆具有BglII单酶切位 点, 与国外 报道 的相 同( 图3).2322