PDF《油茶果糖 - 1,》

6 - 二磷酸醛缩 酶不仅影响脂肪酸的合成, 而且为油脂骨架的构建 提供原料.因此, 本文根据本实验室构建的油茶种 仁转录组数字化文库分析, 从油茶种仁中分离克隆 了CoFBA4 的全长 cDNA, 采用生物信息学方法对其 进行了较为系统的分析, 并在此基础上开展了亚细 胞定位研究及表达差异检测.

1 材料与方法 1.

1 材料 油茶优良品种'

华硕'

('

HS'

) ( 谭晓风 等,2011)采自湖南省长沙市望城县东城镇中南林 第11 期 曾艳玲等: 油茶果糖 - 1,

6 - 二磷酸醛缩酶基因(CoFBA4)的分子特征与表达分析 业科技 大学油茶基地, '

华鑫'

('

HX'

)、 '

华金'

('

HJ'

)、'

衡东65'

('

HD65'

)、'

衡东17 '

('

HD17'

)、 '

茶陵 78'

('

CL78'

)、 '

茶陵二仙 268'

('

CLEX268'

)、 '

茶陵 二仙343'

('

CLEX343 '

) 等 品种采自 株洲马家河油茶基地, 采样后迅速存于-80 ℃ 超低温冰箱备用. 本生烟(Nicotiana benthamiana)、 载体 pEGAD 和农杆菌( Agrobacterium tumefaciens)菌株 GV3103 为湖南大学生物学院生物 能源与 材料研究中心惠赠, 大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 DH5 为本实验室保藏. 1.

2 酶与试剂 TransStartTM FastPfu DNA Polymerase 和pEASY-Blunt Simple Cloning Kit 购自北京全式金 生物技术有限公司,2 * Taq PCR MasterMix、 质粒提 取试剂盒和 DNA 凝胶回收试剂盒购自天根生化科 技(北京)有限公司, RNA 提取和反转录试剂盒购自 Invitrogen 公司, QuantiFast SYBR Green PCR Kit 购自QIAGEN 公司. 1.

3 方法 1) 总RNA 提取与 cDNA 合成 取油 茶近成熟种仁, 根据 RNA 提取和反转录试剂盒说明 书提供的方法提取总 RNA, 电泳检测之后, 逆转录 成cDNA 第1链, 用RNaseH 消化 cDNA 产物. 2) 全长 cDNA 克隆 根据本实验室构建的'

华硕'

油茶转录组数据库得到的 CoFBA4 基因序列设 计特 异引物, 分别为CoFBA4F: GTCCTCCTCCTGC CGATTCGCCACT;

CoFBA4R: AATCGGCAGGAGGA GGACGATCCAG, 由北京华大生物技术有限公司合 成.PCR 反应体系(50 μL) 为5'

* Trans Start Fast Pfu Buffer ( Mg2 + plus) 10.

0 μL,2.

5 mmol・L -

1 dNTPs 5.

0 μL, cDNA 1.

0 μL, Trans Start Fast Pfu DNA Polymerase 1.

0 μL,CoFBA4F(10 μmol・L -

1 )

1 μL, CoFBA4R(10 μmol・L -

1 )

1 μL, 超纯水 31.

0 μL.PCR 扩增条件为

95 ℃ 预变性

5 min;

95 ℃ 变性30 s,

55 ℃ 退火

30 s,

72 ℃ 延伸

1 min,

35 个循 环;

72 ℃ 延伸

8 min;

4 ℃ 保温.采用 1. 2% 的琼脂 糖凝胶电泳, 根据试剂盒说明进行回收连接, 转化大 肠杆菌 DH

5 菌株, 抗生素筛选后提取阳性克隆质 粒, 委托上海博尚生物技术有限公司测序. 3) 序列生物信息学分析利用NCBI 的BLAST 功能(http: ∥ www. ncbi. nlm. nih. gov / BLAST)搜索同源的核苷酸序列及氨基酸序列;

利用MEGA 4.

0 ( http: ∥ www. bio-soft. net ) 程序的UPGMA 算法构建 FBA 蛋白的系统进化树;

利用软 件AnthePro 5. 0(http:∥www. bio-soft. net) 进行蛋白 跨膜结构预测, http:∥cello. life. nctu. edu. tw 在线进 行亚 细胞定位;

http: ∥ expasy. org /tools /protscale. html 在线分析蛋白亲疏水性;

https: ∥ www. predictprotein. org 在线分析蛋白二级结构. 4) 不同无性系特异表达与出油率检测 取不 同无性系油茶种仁提取 RNA, 逆转录为 cDNA, 采用 实时荧光 PCR 技术确定 CoFBA4 基因的相对表达 量, 每样做3个平行重复检测.PCR 引物分别为qCoFBA4F: GAGATTCTTCTTGATGGGGAT;