PDF《油茶果糖 - 1,》

qCoFB A4R: CATAGTGAGCGTGTATTTGGC.PCR 反应体系为

2 * QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.

5 μL,qCoFBA4F (

10 μmol ・ L -

1 ) 0.

5 μL, qCoFBA4R(10 μmol ・L -

1 )0.

5 μL, cDNA 1.

0 μL, 超 纯水9.

5 μL.PCR 扩增条件为

95 ℃ 预变性

5 min;

95 ℃ 变性

10 s,

55 ℃ 退火

30 s, 共40 个循环.油脂 提取 采用索氏提取法(谢鹏等,2010), 出油率=(提取油茶种仁的油脂质量 /油茶种仁干粉质量) * 100% .利用软件 SPSS Statistics 17. 0( http:∥www. stathome. cn)进行统计学分析. 5) 表达载体构建 根据载体 pEGAD 多克隆位 点设计5'

端添加EcoRⅠ酶切位点的上游引物CoFBA4ZF: 5'

-CCGGAATTCATGGCGTGTTCGAG TT- 3'

;

5'

端添加Sam Ⅰ 酶切位点的下游引物CoFBA4ZR: 5'

-TCCCCCGGGTTAGTAGGTATA GCC- 3'

.以阳 性质粒为模板PCR 扩增, 回收连接至pEASY-Blunt 载体上, 经测序正确后采用 EcoRⅠ 和SamⅠ双酶切连接至载体 pEGAD 多克隆位点, 构建 包含 CoFBA4 和eGFP 融合植物表达载体. 6) 亚细胞定位观察 将融合植物载体转化农 杆菌, 挑取阳性克隆单菌落接种于

3 mL 含有利福平 (Rif,

50 μg・mL -

1 ) 和卡那霉素(Kan,100 μg・ mL -

1 )的LB 液体培养基中,28 ℃ ,180 r・min -

1 培养16 ~

24 h.取1mL 活化后菌液于

50 mL 同样的 LB 培养基中,28 ℃ ,200 r・ min -

1 培养至 OD600 为0.

8 ~ 1. 0.3

000 r・min -

1 , 离心

20 min, 收集菌体 细胞, 用终浓度为

10 mmol ・L -

1 MgCl2 、

10 mmol ・L -

1 MES(调节 pH 至5. 7)、

200 μmol ・L -

1 乙酰丁香酮的 无菌水溶液重悬至 OD600 为1. 0.室温放置

3 h 后, 用去掉针头的无菌

1 mL 针筒浸润生长

1 个月左右 烟草植株中部完全伸长的

3 个叶片.接种后的烟草 植株置于

28 ℃ 、 光 /暗周期(16 h /8 h)培养

36 h, 将 浸润部位剪成 0.

5 ~ 1.

0 cm2 小块, 叶背面朝上, 在激 光共 聚焦显微镜下观察eGFP 的荧光信号, 分析CoFBA4 蛋白的亚 细胞定位.同时, 采用基因枪法将重组质粒转化洋葱( Allium cepa) 表皮细胞, 观察 eGFP 的荧光信号(Hiei et al.,1994) .

5 6

1 林业科学49 卷2结果与分析 2.

1 CoFBA4 基因全长 cDNA 克隆 根据油茶种子 转 录组数据设 计特 异 引物, 结合 RACE 技术, 获得

1 643 bp左右的目的片段, 测序结果表明, 其中包含

193 bp的5'

端非编码区、

265 bp 的3'

非编码区和1 个1185 bp的完整开放阅读框, 编码

394 个氨基酸, 分子 质量为

42 740.

4 Da, 等电点理论值为 7. 55, 即生理中 性下该蛋白为碱性.带负电荷残基(Asp + Glu)数为 40, 带正电荷残基(Arg + Lys ) 数41, 分子式为C1884 H2988 N524 O582 S14 .估算 的半寿期(half-life) 分别为:

30 h(哺乳动物网状细胞, 体外)、>

20 h (酵母, 体内)、 >

10 h(大肠杆菌,体内);

稳定指数( II) 为42. 28, 属于不稳定蛋白.含有果糖 - 1,

6 - 二磷酸醛 缩酶中的底物特异结合位点: R91 , K181 , K263 (图1). 将该油 茶果糖-1,

6 - 二磷酸醛缩酶基因命名为CoFBA4, GenBank 登录号为 JX914590. 图1CoFBA4 基因编码区核酸序列及推导氨基酸序列 Fig.

1 Nucleotide and predicted amino acid sequence of CoFBA4 方框区为底物特异结合位点, 下划线部分为果糖二磷酸醛缩酶活性位点. Specificity binding sites in box,fructose- 1, 6-diphosphate aldolase activity site with underline. 2.