PDF《主要用途》

60 分钟,速度为 100000g 16.(选择步骤)小心移取

500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管 17.移取

5 微升进行蛋白定量测定(注意:建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒- ) 18.即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备 1. 准备好待测样品(例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等) ,置于冰槽里 2. 设定好荧光分光光度仪或荧光酶标仪(温度为 25℃) :激发波长 400nm,散发波长 460nm,并置零 3. 准备好

5 个1.5 毫升离心管,标记为

1 至5号管 4. 分别加入 xx 微升稀释液(Reagent G)到2至5号管 5. 移取 xx 微升标准液(Reagent H)到1号管,混匀 6. 小心移取 xx 微升

1 号管稀释的标准液(Reagent H)到2号管,混匀 7. 小心移取 xx 微升

2 号管稀释的标准液(Reagent H)到3号管,混匀

2 8. 小心移取

20 微升

3 号管稀释的 标准液(Reagent H)到4号管,混匀 9. 将1至5号管置于室温下备用;

标准管浓度见下表 管号 稀释液(Reagent G) 标准液(Reagent H) 标准葡聚糖浓度

1 DD 微升 纳摩尔/升2微升 微升

1 号管 纳摩尔/升3微升 微升

2 号管 纳摩尔/升4微升 微升

3 号管 纳摩尔/升5微升

0 0

三、 标准曲线测定 1. 移取 xx 微升缓冲液(Reagent C)到1.5 毫升离心管 2. 加入

5 微升上述配制的标准液 3. 加入 xx 微升终止液(Reagent E) 4. 放进 80℃恒温培养箱或恒温水槽孵育

30 分钟,避免干枯 5. 加入 xx 微升反应液(Reagent F) ,混匀 6. 放进 50℃恒温培养箱或恒温水槽孵育

30 分钟,避免光照 7. 室温下孵育

30 分钟,避免光照 8. 转移到比色皿或酶标板 9. 即刻放进荧光分光光度仪检测:获得相对荧光读数 10.重复实验步骤

1 至9四次 11.构建标准曲线:纵座标(Y 轴)为相对荧光单位;

横座标(X 轴)为标准葡聚糖浓度(纳摩尔/升)

四、 样品测定 1. 移取 xx 微升缓冲液(Reagent C)到1.5 毫升离心管 2. 加入 xx 微升底物液(Reagent D) 3. 加入 xx 微升上述制备的待测样品 (20 微克微粒体蛋白或

100 微克细胞裂解萃取液蛋白) , 混匀 (注意: 样品须清澈) 4. 室温下(25℃)孵育

30 分钟 5. 加入 xx 微升终止液(Reagent E) 6. 放进 80℃恒温培养箱或恒温水槽孵育

30 分钟,避免干枯 7. 加入 xx 微升反应液(Reagent F) ,混匀 8. 放进 50℃恒温培养箱或恒温水槽孵育

30 分钟,避免光照 9. 室温下孵育

30 分钟,避免光照 10.转移到比色皿或酶标板 11.即刻放进荧光分光光度仪检测:获得样品相对荧光读数 12.根据标准曲线获得样品对应葡聚糖浓度

五、 计算样品活性 [根据标准曲线获得样品对应葡聚糖浓度(纳摩尔/升)X 样品稀释倍数]÷ X xx(分钟)=皮摩尔/毫升/分钟 ÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=皮摩尔/毫克/分钟

3 30030.1 30030.1 注意事项 1. 本产品为

25 次操作,包括标准样 2. 操作时,须戴手套 3. 强化液(Reagent B)为固体状,移取方法为:使用

1 毫升枪头,将尖端部分剪去;

或使用 0.5 毫升 PCR 管的盖子内圈盛满;

或秤重 0.1 克4. 终止液(Reagent E)具有腐蚀性,注意操作安全 5. 建议测定细胞裂解悬液的蛋白浓度,便于计算活性单位之需;

建议使用-Bradford 蛋白质浓 度定量检测试剂盒( ) 6. 荧光测定后,比色皿须清洗彻底 7. 酶活性单位浓度定义:在28℃室温下,pH 7.8 的情况下,每单位酶在单位时间内(每分钟)合成

1 微 摩尔的葡聚糖 8. 待测样本为微粒体,其蛋白浓度为