PDF《利用荧光素酶报告基因检测维生素 D 生物活性 *》

・1275・ * 汉中市科技局项目 (No.

2014ZKC47-07) ;

陕西理工学院博士启动项目 (SLGQD13 (2) -22) ;

陕西省科技创新团队项目 (2012KCT-29) 第一作者 Tel: (0916) 2641253;

E-mail: [email protected] 利用荧光素酶报告基因检测维生素 D 生物活性 * 程佳, 庞田田, 缑晶 (陕西理工大学维生素 D 生理与应用研究所, 汉中 723000) 摘要 目的: 为维生素 D 生物活性或类维生素 D 活性的药物筛选建立体外检测模型.方法: 利用分子生 物学技术构建了含有荧光素酶报告基因的载体.PCR 扩增 CYP24A1 启动子上下游区域, 并插入到含有 红色荧光蛋白 (red fluorescent protein, RFP)和荧光素酶报告基因 (luciferase reporter gene)的pRP-RFP- luciferase 载体中.经PCR、 双酶切和测序鉴定后, 转染至 Hela 细胞, 以RFP 的表达反映转染效率, 荧光素 酶的活性水平反映维生素 D 药物活性的强弱.结果: 经鉴定, 构建的荧光素酶报告基因载体转染 Hela 细 胞后有红色荧光表达, 荧光素酶报告基因检测可有效反映 1,

25 (OH) 2D3 生物活性.结论: 在体外细胞水 平上, 利用荧光素酶报告基因检测维生素 D 生物活性的方法简单可行, 为后续筛选和研发具有维生素 D 活 性的药物奠定基础. 关键词: 维生素 D;

荧光素酶报告基因;

活性测定;

药物筛选;

体外检测模型 中图分类号: R

917 文献标识码: A 文章编号: 0254-1793 (2017) 07-1275-05 doi: 10.16155/j.0254-1793.2017.07.17 Bio-activity detection of vitamin D using luciferase reporter gene* CHENG Jia, PANG Tian-tian, GOU Jing (Vitamin D Research Institute, Shaanxi Sci-Tech University, HanZhong 723000, China) Abstract Objective: To construct a drug screening assay model in vitro for the vitamin D biological activity or analogues with vitamin D activity. Methods: Using molecular biology technology to construct luciferase reporter gene vector. Upstream and downstream region gene fragments of the human CYP24A1 promoter were amplified by PCR and cloned into pRP-RFP-luciferase vector containing red fluorescent protein (RFP) and luciferase reporter gene. After PCR, double enzyme digestion and sequencing, the recombinant plasmid was transfected into Hela cells. The transfection efficiency was reflected by the expression of RFP, the activity of luciferase was used to reflect the activity of human CYP24A1 promoter. Results: Luciferase reporter gene with human CYP24A1 promoter was successfully constructed. Then the vector was transfected into Hela cells, which showed red fluorescence. Luciferase reporter gene assay was confirmed that could effectively reflect 1,

25 (OH) 2D3 activity. Conclusion: The method of using luciferase reporter gene to detect the biological activity of vitamin D in vitro is simple and feasible, which lays a foundation for subsequent screening and development of drugs with vitamin D activity. Keywords: vitamin D;

luciferase reporter gene;

activity assay;

compounds screening;

testing model in vitro ・1276・ 在药物筛选领域, 报告基因技术已经成为一种重 要的研究工具, 其利用药物处理细胞后报告基因的表 达情况来反映药物的活性[1] .报告基因技术是把报 告基因的编码序列与特定的顺式调控序列连接形成 重组基因, 在调控序列控制下进行表达, 从而可直观 地反应细胞内与基因表达有关的信号级联[2-3] .荧 光素酶基因是一种常用的报告基因, 其表达产物易检 测, 且灵敏度高、 特异性好, 广泛应用于体外监测与 细胞的信号转导和基因表达有关的细胞活动等研究 中[4-5] . 25- 羟基维生素D3-24- 羟化酶即CYP24A1, 是维生素 D 代谢过程中的关键酶, 可催化 25- 羟基 维生素 D3 [25 (OH) D3]和1, 25- 双羟基维生素 D3 [1,