PDF《利用荧光素酶报告基因检测维生素 D 生物活性 *》

200 μ L 无菌 ddH2O 中,

37 ℃、

220 r・min-1 振摇

30 min. 取上述1μL 菌液作为模板进行PCR, 反应体系(25 μL) : buffer 2.5 μ L, dNTP 2.0 μL , 上下游引物各 0.5 μ L, 菌液

1 μ L, Taq 聚合酶 0.2 μ L、 ddH2O 18.3 μ L. 扩增反应程序同 1.2.1 所述.经1% 琼脂糖凝胶电 泳检测与目的片段大小一致的菌落即为阳性克隆. 将阳性克隆进行扩大培养, 再利用质粒提取试剂盒抽 ・1277・ 提重组质粒.取重组质粒进行双酶切验证, 体系与程 序同 1.2.2 所述.经双酶切验证后的质粒送往西安 东奥公司进行测序. 1.2.4 重组质粒转染 Hela 细胞 将细胞接种于六孔 板中, 以转染时细胞密度在 60%~80% 为宜.按照质 粒转染说明书, 制备转染复合物;

将转染复合物加入 细胞培养基中, 混匀;

培养

24 h, 换液并观察荧光. 转染分单质粒Luciferase (Luc 组)和双质粒VDR-Luc 组.Luc 组共设

15 孔, 转染

36 h 后, 每孔 以含有不同浓度活性 1,

25 (OH) 2D3 的培养基处理 (5 个浓度分别为:

0、 0.

01、 0.

1、

1、

10 nmol・L-1 ) , 每 个浓度

3 个重复.VDR-Luc 组的双质粒比例 (VDR/ Luc) 分别为:

0 ∶

1、

1 ∶

1、

2 ∶

1、

3 ∶

1、

4 ∶ 1, 各比例

3 个重 复, 两组共

30 孔.转染

36 h 后, 一组 (15 孔) 加入含 有0.1 nmol・L-1 活性 1,

25 (OH) 2D3 的培养基进行 处理.另一组 (15 孔)加入不含有活性 1,

25 (OH) 2D3 的培养基进行处理.单/双质粒组均在转染

48 h 后, 观察荧光.每孔加入

1 mL 预冷的 PBS, 吹打细胞 脱落, 将细胞悬液移至离心管中. 1.2.5 荧光素酶检测 用萤火虫荧光........