PDF《江苏农业学报（ Jiangsu J.of Agr.Sci. ） ꎬ2》

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0 1 干扰素应答是抵御病毒感染的第一道防线?其中I型干扰素可与细胞表面特定受体结合?激活 JAK~STAT 级联信号放大系统?诱导相关效应器的表 达?产生抗病毒蛋白? Viperin 是其中一种重要的抗 病毒蛋白?最早在感染人细胞巨化病毒的成纤维细 胞中被发现[1] ? Viperin 一级结构具有

3 个不同的 区域:N 末端(长度和序列随物种变化而变化的区 域)、中央保守区域(又称 SAM 区域)以及高度保守 的C末端[2] ? 除了人细胞巨化病毒外?还有十几种 病毒可诱导 Viperin 表达?包括仙台病毒、水泡性口 炎病毒、丙肝病毒、伪狂犬病毒、日本脑炎病毒、辛德 毕斯病毒和西尼罗病毒等[3~6] ? Viperin 对不同病毒 的抗病毒机制不同?其中关于 Viperin 对丙肝病毒影 响的报道比较多?Viperin 蛋白亚细胞定位可通过 N 端将 Viperin 蛋白定位在细胞的内质网(ER)、脂滴 以及线粒体上? 病毒核蛋白 C 最初定位于 ER 胞浆 面?成熟后移位至脂滴? 脂滴不仅是储存、运输脂质 的结构?而且参与多种代谢性疾病的发生? C 蛋白 使病毒非结构蛋白和复制复合物向脂滴聚集? Vi~ perin 可能影响 ER 膜上脂质的种类和数量?进而影 响病毒感染后脂滴的形成、形状以及病毒蛋白的定 位?从而发挥抗病毒作用[7] ? Viperin 对流感病毒的 抑制是通过破坏脂筏结构和抑制病毒的出芽释放来 发挥作用的? Viperin 与法尼基焦磷酸合酶(FPPS) 结合并抑制其活性?影响胆固醇和类异戊二烯的生 物合成?从而破坏脂筏结构[3] ? viperin 基因作为先天性免疫中的干扰素刺激基 因?在抵御多种病原的入侵中起着重要作用?然而大 多数干扰素刺激基因(ISGs)的抗病毒机制未知?Vi~ perin 是近年来新发现的一种信号蛋白[8] ? 本研究 拟利用鸭 viperin 基因产物?构建鸭 viperin 基因真核 表达质粒?转染至 DF~1 细胞?观察 Viperin 蛋白在真 核细胞中的表达情况?然后接种坦布苏病毒?测定病 毒滴度?以期为 Viperin 蛋白抗病毒活性的初步评价 提供依据?

1 材料与方法 1.1 病毒、质粒和菌株 坦布苏病毒分离株(JS804)、新城疫病毒株、E. coli DH5α 菌株和真核表达载体 pEGFP~N1 均由本 实验室保存? 1.2 主要试剂 限制性内切酶、Ex Taq DNA 聚合酶、pMD18~T 载体、T4 DNA 连接酶和蛋白质相对分子质量标准 等均购自宝生物工程(大连)有限公司?DMEM 细胞 培养基和胎牛血清均购自 Gibco 公司?质粒小量提 取试剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒均购自 Axygen 生 物科技有限公司?其他试剂均为国产分析纯? 基因 序列合成、引物合成和测序均由南京金斯瑞生物科 技有限公司完成? 1.3 引物设计 根据 GenBank 中鸭 viperin 的基因序列 ( Gen~ Bank No. KP198582)设计

1 对PCR 扩增引物?上游 引物(VF) 序列为:5′~GAATTCTGATGCATCTGGGT~ GCACTG~3′?划线部分为引入的 Eco R I 酶切位点? 下游引物( VR) 序列为:5′~GTCGACTTAGCCAGTC~ CAGTTTCAT~3′?划线部分为引入的 Sal I 酶切位点? 这对引物由南京金斯瑞生物有限公司合成?预期扩 增片段大小约为

1 000 bp? 1.4 鸭viperin 基因的克隆 参照文献[9]进行鸭外周血淋巴细胞培养? 当 细胞长成良好的单层后?加入新城疫病毒?于37 ℃ 下培养

3 h?收集诱导液?然后再与 poly (I ∶ C)一起 于37 ℃ 下联合培养

7 h? 利用 Axygen 公司细胞 DNA/ RNA 提取试剂盒提取总 RNA?参照 TaKaRa 反 转录试剂盒说明书将其反转录成 cDNA?备用? 以鸭viperin cDNA 产物为模板进行 PCR 扩增?PCR 反 应体系为 25?