PDF《江苏农业学报（ Jiangsu J.of Agr.Sci. ） ꎬ2》

00 μl?其中双蒸水 15?

00 μl?10 *Ex PCR buffer 2?

50 μl?2?

5 mmol/ L dNTP 2?

00 μl?25?

0 mmol/ L MgCl2 1?

50 μl? 上、 下游引物(25?

0 pmol/ μl)各1?

00 μl?cDNA 产物 1?

50 μl?Ex Taq (5 U/ μl) 0?

50 μl? PCR 反应程序设置如下:94 ℃ 预 变性

5 min?94 ℃变性

30 s?53 ℃退火

30 s?72 ℃ 延伸1min?30 个循环?72 ℃ 延伸

10 min? 反应结束 后?对PCR 扩增产物进行 1? 5%琼脂糖凝胶电泳分 析?切取目的条带进行胶回收? 纯化的 PCR 产物片 段首先与 pMD18~T 克隆载体进行连接?转入 E? coli DH5α 感受态细胞? 经酶切鉴定后?挑选阳性克隆 质粒送南京金斯瑞生物有限公司测定基因序列? 1.5 生物信息学分析 用DNAStar 7.0 软件对不同物种的 viperin 基因 序列和推导的氨基酸序列进行同源性比对?分析不 同物种之间的序列差异? 用MEGA 5.0 软件构建 vi~

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1 1 江苏农业学报2017 年第33 卷第5期perin 基因的系统发育树?用Prot~Param Tool 软件分 析氨基酸组成和等电点等理化性质?用SignalIP 4.0 Server 软件分析蛋白质序列的信号肽?用ProtScale 软件分析蛋白质的疏水性?用Conserved domains 软 件分析鸭 viperin 基因的保守区结构域?用TMpred 软件分析蛋白质的跨膜区? 1.6 鸭viperin 基因表达质粒 pEGFP~N1~viperin 的 构建 用Eco R I+Sal I 双酶切阳性质粒 pMD18~T~vi~ perin 和空载体 pEGFP~N1?胶回收?T4 DNA 连接酶 进行连接?构建重组表达质粒 pEGFP~N1~viperin? 将 连接产物转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中?在 含有卡那霉素的 LB 固体培养基上培养

14 h?随机 挑选阳性单一菌落接种于含有卡那霉素的 LB 液体 培养基中?置于

37 ℃ 摇床中?180 r/ min?14 h 后用 质粒小提试剂盒提取质粒?送至金斯瑞生物科技有 ........