PDF《AxyPrep 无内毒素质粒小量试剂盒》

5 min. 4. 加350 ?l Buffer S3,温和并充分地上下翻转混合 6-8 次,12,000*g 离心

10 min. * 避免剧烈摇晃,否则将导致基因组 DNA 污染. 步骤 5~8 可以选择负压法或离心法纯化质粒 DNA. A. 负压法 5A. 将质粒 DNA 制备管插到负压装置的接口上. 吸取步骤

4 中的离心上清并转移到制备管中, 开11/05 Ver.1 爱思进生物技术(杭州)有限公司

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3 启并调节负压至C25-30 英寸汞柱,缓慢吸走管中溶液. 6A. 加500 ml Buffer W1,吸尽管中溶液. 7A. 加700 ml Buffer W2,吸尽管中溶液;

以同样的方法再用

700 ml Buffer W2 洗涤一次. * 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇. * 两次使用 Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除,消除对酶切反应的影响. 8A. 将制备管置于

2 ml 离心管(试剂盒内提供)中,12,000*g 离心

1 min. B. 离心法 5B. 吸取步骤

4 中的离心上清并转移到制备管(置于

2 ml 离心管(试剂盒内提供)中) ,12,000*g 离心

1 min,弃滤液. 6B. 将制备管置回离心管,加500 ml Buffer W1,12,000*g 离心

1 min,弃滤液. 7B. 将制备管置回离心管,加700 ml Buffer W2,12,000*g 离心

1 min,弃滤液;

以同样的方法 再用

700 ml Buffer W2 洗涤一次.弃滤液. * 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇. * 两次使用 Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除,消除对酶切反应的影响. 8B. 将制备管置回

2 ml 离心管中,12,000*g 离心

1 min. 9. 将制备管移入新的 1.5 ml 离心管(试剂盒内提供)中,在制备管膜中央加

150 ml Eluent A,室温静 置1min.12,000*g 离心

1 min. 10. 弃制备管.在滤液中加入

150 ?l 预冷的 Buffer ETR,剧烈混合

1 min. * 如果 Buffer ETR 浑浊,于冰上静置,直至溶液变得清亮;

如果出现分层,则需混合均匀后使用. 11. 加入

38 ?l Buffer PF,混合均匀. 12. 置于

42 °C 孵育

2 min.12,000*g 离心

2 min. * 孵育后溶液为浑浊. 13. 取无色上相至 1.5 ml 离心管(试剂盒内提供)中,加入 0.8 倍体积异丙醇(如:取得

350 ?l 无色 上相,则加入

280 ?l 异丙醇) ,混合均匀.室温静置

10 min.12,000*g 离心

10 min. * 质粒含量较少时,会影响对沉淀的观察,此时需要在离心管上标记离心方向,以便观察和后续处理. 14. 尽可能弃尽上清.加入

1 ml 预冷的 ET-free water(70% Ethanol) ,12,000*g 离心

5 min. * ET-free water(70% Ethanol)使用前确定已加入指定体积的无水乙醇. 15. 尽可能弃尽上清.在超净台中干燥 5-10 min. * 管壁上残留液体可短暂离心后吸弃. 11/05 Ver.1 爱思进生物技术(杭州)有限公司

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4 16. 加入

60 ?l Eluent A 溶解质粒 DNA.

五、流程图 加250 ml Buffer S1 加250 ml Buffer S2 加350 ml Buffer S3 加500 ml Buffer W1 加700 ml Buffer W2 加700 ml Buffer W2 加150 ml Eluent A 加150 ml Buffer ETR 加38 ml Buffer PF

42 °C 孵育

2 min 12,000*g 离心2 min 加0.8 体积异丙醇至上相 加1 ml 预冷的ET-free water(70% Ethanol) 加60 ml Eluent A 裂解 中和 结合 洗涤 洗脱 内毒素去除 分相 沉淀质粒 溶解质粒