PDF《DO I :》

450 bp 的DNA 扩 增产物, 见图 1. 2.

2 LTB 融合表达质粒的构建 将构建的 LTB 融合表达质粒 pLV2 .

0 转化 E . coli DH5α , 氨 苄青霉素抗性 LB 平板筛选酶切鉴定阳性重组子, 见图

1、2. 取 阳性克隆测序, 结果扩增的 LTB 基因序列与 GenBank 公布的完 全一致. 2.

3 LTB-UreB 的融合表达 从pBHP 中EcoRⅤ切下 ureB 基因片段与 EcoRⅤ酶切的 pLV2 .

0 连接, 利用 ureB 基因中 BamH Ⅰ 酶切位点鉴定正、反向 阳性重组子, 构建 LTB-UreB 的重组质粒 pLV2. 1, 见图

1、2. 同 样的, 正向重组子转化 E . coli JM109, IPTG 诱导, SDS -PAGE , 分 别以兔抗 LT、兔抗 Hp 抗血清作免疫印迹证实在分子量约

75 *

103 位置表达了一特异蛋白带, 重组蛋白表达量约

19 %, 见图

3 .GM1-ELISA 亦证明重组蛋白具有与GM1 结合的能力. M1. PCRMarker;

1: ltB PCR product( 0.

45 kb) ;

2: PinPiont Xa EcoR Ⅰ+ EcoRⅤ digestion( 2.

8 kb) ;

3: pLV2.

0 EcoR Ⅰ+EcoRⅤ digestion( 2. 8+ 0.

45 kb) ;

4: pLV2.

1 EcoRⅤdigestion( 2. 8+ 2.

2 kb) ;

5: pLV2.

1 EcoR Ⅰ +EcoRⅤdigestion( 2. 8+1. 7+0.

45 kb) ;

6: pLV2.

1 sense recombi- nant BamH Ⅰ digestion( 4.

0 +1.

0 kb) ;

7: pLV2.

1 anti-sense recombi- nant BamHⅠ digestion( 4. 3+0.

7 kb) ;

M2: λ DNA HindⅢ Marker 图1重组质粒的酶切鉴定 Fig

1 Detemination of the recombinant plasmid 图2重组质粒的构建示意图 Fig

2 Scheme of the construction of the recombinant plasmid

1276 第三军医大学学报第25 卷A: SDS-PAGE B : Western-blot( 1: rabbit antiserum to LT;

2: rabbit antiserum to Hp ) ;

1: JM109;

2: pLV2.

0 JM109;

3: Untreated pLV2.

1 JM109;

4: PLV2.

1 JM109 treated with 1mmol L IPTG for

9 h;

M: Low mass weight marker 图3融合蛋白的表达 Fig

3 Analysis of the expression of the fusion protein

3 讨论 LTB 亚单位缺乏 LT 全毒素分子的毒性 ,但保留了 作为粘膜免疫佐剂的作用 .LTB 作为口服疫苗的抗原 投递载体已引起人们的兴趣.Loregian 等[4] 将LTB 与 单纯疱疹病毒( HSV) DNA 聚合酶的

27 个氨基酸残基 的多肽融合表达 ,获得的重组蛋白显示具有抑制病毒 DNA 聚合酶活性进而影响病毒的复制 ,表现出抗病毒 能力 .Rock 等[5] 报道, LTB 与人绒毛膜促性腺激素 ( hCG) β 亚基的羧基末端肽融合表达产物免疫小鼠 ,产 生了识别重组 hCGβ 亚基或天然 hCG 的抗体反应, 可 能作为避孕疫苗使用 .Jobling 等[6] 利用 LTB 基因与肺 炎链球菌表面蛋白A( PSPA) 的基因融合表达了具有免 疫活性的重组蛋白. 为了使 LTB 能与多种外源抗原基因融合表达 ,我 们构建了 LTB 通用融合表达载体 pLV2 .

0 .该质粒具 有如下特点: ①利用了高效表达载体 PinpointXa 的强 大、 可调节启动子和转录终止子;

②保留了 LTB 起始 密码子AUG 上游的 SD 序列 ;

③ 去掉了 LTB 的终止密 码子 ,在其后引入了多个专一限制性酶切的多克隆位 点;

④在LTB 与被融合蛋白之间设计了

4 个氨基酸 TAPI的接头( Linker) , 目的是干扰 α -螺旋的形成以最 大保持 LTB 与被融合蛋白二者的天然构象 ;

⑤带有 LTB 的信号肽序列 ,表达产物为分泌型蛋白. 以构建的 pLV2 .

0 为载体 , 选择多克隆位点中的 EcoRⅤ酶切位点 ,融合幽门螺杆菌尿素酶 B 亚单位全 长基因 , 构建了 Hp ureB 的分子内佐剂疫苗, GM1- ELISA 及Western blotTING 证实了其表达. 因此, 此融合表达载体的成功构建为研究以 LTB 作分子内佐剂之疫苗奠定了基础. 参考文献 : [ 1] de Haan L , Verweij W, Agsteribbe E , et al . The role of ADP-ribosylation andGM1-binding activity in the mucosal immunogenicity and adjuvanticity of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin and Vibro cholerea cholera toxin[ J] . Immun Cell Biol, 1998, 76( 20) : 270-279. [ 2] J・萨姆布鲁克 ,EF・弗 里奇 , T・曼 尼阿蒂 斯著 . 分子 克隆 实验指 南[M] .第 2版 .北京 : 科学出版社 ,