PDF《变形链球菌表面蛋白编码基因载体质粒pMD-pac构建》

132 [文章编号]1000-2200(2008)024)132-03 ・基础医学・ 变形链球菌表面蛋白编码基因载体质粒pMD-pac构建 吴志刚1.

刘建国2.洪献忠3 【摘要】目的:获取变形链球菌国内临床株表面蛋白PAC编码基因pac并构建载体质粒,为构建植物表达基因载体做前期准 备.方法:以国内检出率最高的变形链球菌临床分离株(血清C型)的基因组DNA为模板,通过PCR扩增获取表面蛋白PAc 编码基因pac;

通过T.A克隆构建中间载体pMDl8一pae质粒,对其分析鉴定.结果:目的基因成功的连接到中间载体上.结论:获取的目的基因经测序和比对表明,其与变形链球菌表面蛋白的相关编码基因在核苷酸序列和蛋白同源性上都很高,可 以作为抗原基因进一步研究. 【关键词】变形链球菌;

质粒;

表面蛋白抗原;

基因疫苗 [中国图书资料分类法分类号】R 378.12;

R 394.2 [文献标识码】A Construction of recombinant plasmid can'

yiIIg pac genes of Streptococcus mutans b湖r'

faee protein WU Zhi―gan91,LIU Jian-guo.,HONG Xian―zhon93 (1.Department ofStomatology,The First筋l诹d Hospital ofBengbu Medical College,Bengbu Anhui 233004;

2.Department ofOral Medicine,Affiliated Swnunotogical Hospital of驯Medical College,zunri Gu/zhou 563003;

3.Department ofStomatology.Longsai Hospital ofZhenhai District,1wngbo Zhejiang 321000,C/aria) [Abstract]Objective:To obtain the pae gene encoding 8urface protein PAC of Streptococcus mutans(S.m咖砸),which心isolated from clinical strain in China,and to construct the recombinant plagmids vector containing the pac gene,which will provide缸thel-study for edible plants vaccine against dental caries.Methods:According to the sequence of pac gene,a pair of pae gene specific primers W88 designed and synthesized;

By using PCR the target DNA fragment was amplified from genome of semtype c of S toucans which was highest frequency of clininal isolates in China.The recombinant intermediate vector pMDl8-pae WaS constructed through T-A cloning and identified by sequencing.Results:The sequences of cloned pac gene Wag high homology with that of pae gene reported from refbrence8.Conclusions:The sequence of pac gene obtained in this study C811 be used to further study for preparation of DNA vaccine against dentalcaries. [Key words]Streptococcus mutans;

plagmids;

sudaee protein antigen;

genetic engineering vaccine 变形链球菌群(Mutans streptococci,MS)是人和 动物的主要致龋菌,从人类口腔中检出的MS主要 是变形链球菌(Streptococcus mutans,简称变链菌,血 清型c、e、f)和远缘链球菌(Streptococcus sobrinus,血 清型d、g)¨'

2J,尤其是血清型c变链菌检出率最高, 可达80%H J.表面蛋白PAC是变链菌表面主要的 粘结素之一,全分子表面蛋白或其多肽片段在体外 都具有较好的免疫原性,提示他们的相应编码的 pac基因都可能作为候选抗原基因.但不同变形链 球菌的粘结素不同,与之反应的唾液成分(配体)不同,粘结素与不同配体结合,生物学意义可能也不 同.本实验采用临床检出率最高的分离株(血清e 型)H1的基因组DNA为模板,根据报道的pac基因 [收稿日期]2007-11-02 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30160086) [作者单位]1.蚌埠医学院第一附属医院口腔科,安徽蚌埠 233004;

2.遵义医学院附属口腔医院,贵州遵义 563000;

3.浙江省宁波市镇海区龙赛医院口腔科,浙江 宁波321000 [作者简介]吴志剐(1974一),男,硕士,住院医师. [通讯作者]刘建国,博士,主任医师,教授. 序列设计合成引物体外扩增目的基因,以进一步研 究其与国外报道的基因之间的同源性,并构建国内 临床株表面蛋白编码pac基因的中间质粒载体.为 下一步的转基因植物表达载体构建做前期准备,进 一步与其他变形链球菌菌株来源的表面蛋白编码基 因【51进行对比研究. 1材料与方法 1.1 主要试剂与仪器TakaRa LA TaqDNA聚合 酶,DNA分子量Marker入一Ecotl4 digest,Ligation Kit Ver.2连接试剂盒,pMDl8・T Vector、Control Insert (TakaRa生物工程有限公司,大连).胶回收试剂盒 (元泰,成都),基因组DNA抽提试剂盒(北京赛百 盛),RNase A(Sigma公司,美国),低熔点琼脂糖 (Sigma公司,美国),余均为分析纯级化学试剂. 职C-lOOTM型PCR仪(MJ Research,lnc.,美国). 1.2菌种变形链球菌临床分离株和标准株(四 川大学华西口腔医学院分子生物学实验室刘天佳教 授惠赠),JMl09菌株(中科院成都生物所马欣荣博 士惠赠). 1.3 方法 1.3.1 引物的设计与合成根据文献№o报道的 pac基因序列在National Bioscience Inc研制的分子 生物学软件Oligo 6.0上设计合成并评价PCR引物.引物由TaKaRa生命技术工程公司合成并经高 效液相色谱法(HPLC)脱盐纯化定量.上游引物5'