PDF《变形链球菌表面蛋白编码基因载体质粒pMD-pac构建》

一GCG CCA 7rAT GAA GGT CAA AAA AAC rITIIA CGG Trr TCG-3'

;

下游引物5 7-GGC GGT ACC ATC 7rrr CTT AGC CTr'

rAA ACC AAG C-3'

. 为便于目的基因与原核表达载体pET32a(+) 的定向重组,在上游引物的5 7端加入NdeI限制性内 切酶酶切位点,在酶切位点的5'

端有4个保护性碱 基.下游引物的5 7端加入印nI限制性内切酶酶切 位点和3个保护碱基,并去除终止密码,以便下一步 与霍乱毒素B亚单位(CTB)基因嵌合,表达融合蛋 白. 1.3.2变形链球菌基因组DNA提取及鉴定取变 形链球菌C型临床株将菌种接种rIPY平皿,37℃微 需氧培养48 h,检查菌落生长情况,镜检无污染.挑 单菌落接种Ⅱ'

Y液体培养基,37℃微需氧培养

48 h,镜检无污染.DNA抽提试剂盒提取各菌株 DNA.紫外分光光度计测定DNA在260 nm和280 nln处的吸光度值(OD)值.0.7%琼脂糖凝胶电泳 (80 V,2.5 h),20℃保存. 1.3.3 目的基因片段的体外扩增PCR反应体 系:变形链球菌基因组DNA l斗l,10*LA PCR buffer II 5山,MgCl2(25 mm01)5一,dNTP mixture (各2.5 mm01)8一,上游引物(10 pmoV一)2出, 下游引物(10 pmoL/山)2 p.1,LA Taq 0.5 V,1,ddH20 6.5斗l共50灿l.循环参数:94℃5 min,(94℃ l min,55 oc

1 min,72 oC

4 rain)x35个循环,72℃ 延伸10 mino 1.3.4回收与纯化扩增产物PCR产物以0.7% 低融点琼脂糖凝胶电泳验证是否获得4.7 kbp大小 的目的基因.按照试剂盒操作说明方法用胶回收试 剂盒回收PCR产物,一20℃保存. 1.3.5连接反应(1)取实验一已纯化的pac基因 PCR扩增产物1¨l,pMDl8一T Vector

1 l,Ligation Kit Ver.2连接试剂盒中的solution

110 td,ddH20

8 m.(2)阳性对照pMDl8一T Vector l wl,Control Insert I一,solution 110斗l,ddH20 8山,将上述2管 置于forotoe恒温金属浴16 oC*12 h. 1.3.6感受态细胞的制备及连接产物的转化参 照文献执行¨J. 1.3.7重组子的筛选和提取参照质粒提取试剂 盒说明书进行.

133 1.3.8重组子的酶切鉴定根据pMDl8一pac载体 和已知的pac序列选取睁nI、NdeI、XhoI、SalI做单 酶切,砀nI、NdeI双酶切. 1.3.9测序将已构建并酶切鉴定的质粒pMDl8一pac送上海联合基因公司测序. 2结果 2.1 DNA定量及鉴定变形链球菌临床分离株和 标准株全细菌基因组DNA抽提产物经1%琼脂糖 凝胶电泳均为单一条带,约23 kbp,证实其完整,无 降解,无RNA污染.OD260/OD2∞比值为1.6一1.8 之间,说明抽提产物无蛋白质、酚污染(见图1). M:k一厨dⅢDNA Marker,l一7:C型临床株 图l S mutans菌株DNA条带 2.2 PCR扩增产物电泳结果 以变形链球菌(血清c型)临床分离株基因组DNA为模板,扩增出约 4.7 kbp的目的基因片段,分子量与预计的相同(见图2). M1:制备的4.7 kbp对照;

1、3如:临床分离株: 2:空白对照;

M2:k-Eeotl4 Marker 图2 S mutans临床分离株pae基因扩增产物 2.3重组子的酶切鉴定NdeI单酶切切出大小约

150 bp、7

250 bp左右两个片断;

XhoI、SalI单酶切切 出一约7

400 bp大小的片断;

KpnI单酶切切出的片 断在电泳图上只看到一条约7

400 bp的片断,但分 析酶切图谱可知应该还有一大小20 bp的小片段考 虑在此无法分辨;

KpnI和NdeI双酶切获得4

700 bp、2

550 bp、150 bp左右3个片断(见图3).通过 以上酶切分析,pac基因为反相插入到pMDl8一T Vector(随后酶切分析了其它12个重组子也是如 此,原因尚不清楚)(见图4),但因为是中间载体故 并不影响下一步实验的进行.

134 M:k―Eeotl4 Marker.1:Nde I;