PDF《分子人类学中的单核苷酸突变检测方法的研究进展》

000 个碱基对中就有一个 SNP,估计 总数可达 3*106 个,甚至更多 [3] ,是最常见的人类 可遗传的变异, 占所有已知多态性的 90% 以上.(2) 易于基因分型.组成 DNA 的碱基虽然有

4 种,但SNPs 一般只有两种碱基组成,所以它是一种二态 的标记,即二等位基因 (biallelic).这种非此即彼的 二态性使基因分形更加简单.(3) 适于快速、规模 化筛查.SNPs 的二态性使得在基因组筛选中 SNPs 往往只需 +/- 的分析,而不用分析片段的长度,这 就利于发展自动化技术筛选或检测 SNPs.(4) 稳定 遗传.处于编码区的 SNP(cSNP) 是高度稳定的,它 会随着生物的繁衍传递给下一代. 由于 SNP 具有数量多、分布广和稳定遗传等 特点,分子人类学把 SNP 作为常用的遗传标记来 标定群体内和群体间的单倍型、遗传距离等.

2 SNP检测技术的原理 SNP 与许多遗传疾病 ( 如血友病和苯酮尿病等 ) 直接相关,是决定人类疾病易感性和药物反应差异 的主要因素.因此,人类群体分型、新药研究、个 体化用药、临床检验和分子诊断中的 SNPs 分型具 有十分重大的意义.对SNPs 的广泛关注刺激了检 测技术突飞猛进的发展. 按照 SNP 位点区分方法,检测技术可以分为 以下几大类.(1) 基于杂交的方法.包括 ASO (allele- specific oligonecleotide, 等位基因特异核苷酸片段 ) 杂交、LNA(locked nucleic acid) 杂交、molecular bea- cons( 分子信标 )、scorpion primer、DASH(dynamic allele-specific hybridization, 动态等位基因特异杂交 ) 等.(2) 基于 PCR 或酶的方法.在杂交的基础上增 加酶促反映,提高检测的可靠性和准确性.(3) 以 构象为基础的方法. SNP 位点引入 DNA 分子后引 起其构象的改变或 Tm 值的不同.这些差异在温度 梯度凝胶电泳中表现为电泳迁移率的不同 , 而将突 变体检测出来.(4) 直接测序法.直接将含有目标 SNP 位点的一段核酸序列做为目的片段,对该段序 列进行直接测序.这一方法的 SNP 检出率为 100%[4] .

3 分子人类学中的SNP检测技术 3.1 PCR-RFLP法PCR-RFLP 法是最早应用于分子人类学的 SNP 检测技术.该技术用 PCR 反应扩增纯化后的 DNA, 随后用限制性核酸内切酶将扩增产物切成 限制性 片段 . 限制性内切酶是一类识别 DNA 特异位点 ( 通常4~6 bp) 并在特异位点将双链 DNA 中戊糖与磷酸 之间的糖苷键切断的酶类 ( 酵素 ).用限制性内切 酶消化特定 DNA 会产生同样的片段.而SNP 可以 产生或消除一个特定酶切位点,从而改变酶切割后 产生片段的大小和数目.每个个体的酶切位点之间 的距离会有差距,限制性片段的长度就有区别.将 限制性片段进行琼脂糖凝胶电泳,不同个体的条带 位置将会表现出多态性,即限制性片段长度多态性 (RFLP),从遗传水平上区分不同个体. 该技术简单易操作,对于检测单拷贝上 (Y 染 色体和线粒体 ) 的SNP,准确度非常高.但由于酶 切的不完全导致无法判断杂合子,该技术对常染色 体上的 SNP 检测不是很准确.实际上大约一半的 SNP 位点并不改变限制性酶切位点,这一点可以通 过设计包含酶切位点的错配引物来克服 [5] ,但错配 的引物在 PCR 扩增时可能会产生一定的困难. 基于 PCR 反应的限制性酶切位点多样性分析 (PCR-RFLP analysis) 在分子人类学线粒体基因分型 中得到了广泛的应用,所涉及到的位点包括

10397 AluI、5176AluI、4831HhaI、13259HincII、663 HaeIII、12406HpaI、9824HinfI、3394HaeIII、