PDF《分子人类学中的单核苷酸突变检测方法的研究进展》

3010、

4715、

5417、10310 等[6-7] . 3.2 直接测序法 线粒体 DNA (mtDNA) 是真核生物线粒体中含 有的、在线粒体中复制和表达的 DNA,为双链环 状分子,每个细胞的拷贝数可达数千,属于母系遗 传.线粒体 DNA 含有的基因能编码部分线粒体蛋 白质 ( 如膜蛋白 )、组成线粒体自身翻译体系的转 移核糖核酸(tRNA) 和核糖体核糖核酸(rRNA). mtDNA 可分成编码区和非编码区 (D- 环区 ) .D - 环区是 mtDNA 分子复制和转录的调控中心 , 也是 胡抗,等:分子人类学中的单核苷酸突变检测方法的研究进展 第1期121 mtDNA 和核基因组之间进行信息交换的枢纽.由于D- 环区多态性较高,又称为高变区.通常分为 高变区 I (HVR I)、 高变区 II (HVR II) 及其周边区域. 线粒体高变区 I (HVR I),即线粒体非编码区 (D- 环区)16 024~16

383 碱基序列 [8] . SNP 研究中经常应用直接测序法,即双脱氧链 终止法 (dideoxy chain-termination method),又称桑 格法 (sanger method).对样本的线粒体高变区 I (hyp- ervariable region I, HVRI) 进行测序,然后比对标准 序列,从而得到样本 HVR I 序列内的所有 SNP 位点 信息. 直接测序法由 Sanger 等于

1977 年发明,其原 理为 :将模板在 DNA 聚合酶、引物、4 种单脱氧 核苷酸 (dNTP,包括 dATP、dGTP、dCTP 和dTTP, 其中一种以放射性

32 P 标记 ) 环境中复制,分成

4 个独立的测序反应,分别按比例加入

4 种双脱氧核 苷酸 (ddNTP).链延长反应在结合到一个双脱氧核 苷酸时,因为缺少一个形成磷酸二酯键所必需的 3'

-OH 而使 DNA 链终止延伸,由此产生不同长度 的DNA 片段.新合成的 DNA 片段热变性后通过 变性丙烯酰胺凝胶电泳根据链长度而分开,可精确 到一个碱基.变性丙烯酰胺电泳有四个泳道,每个 泳道对应一种碱基.电泳结束后通过放射自显影或 紫外显影可读出 X 光片或凝胶影像.图像中的每一 个暗带表示一个双脱氧核苷酸 (ddATP、ddGTP、 ddCTP、ddTTP) 掺入后链终止的 DNA 片段的结果.

4 个泳道之间的不同暗带的相对位置可以用来读取 ( 从底部到顶部 )DNA 序列 [9] . 随着 Sanger 测序技术的发展,ddNTP 的标记 技术有了很大的提高.不同种类的 ddNTP 可以被 不同荧光基团所标记,这些荧光基团具有相同的激 发波长和不同的发射波长,在光学上表现为不同的 颜色.经ABI-3130XL 测序仪跑胶后,得到和目标 序列匹配的不同颜色峰图 ( 图1).测序反应在一个 体系中进行,这就满足了对测序速度、自动化及通 量不断提高的要求,使直接测序法在 DNA 研究中 得到广泛使用. 直接测序法可以 100% 检测目标序列内的所有 SNPs,具有准确度高的特点,对于在一段很短的序 列上存在多个 SNP 的检测是有优势的.由于它是 针对目标片段所有碱基的全测序,目标片段内所有 碱基 ( 不论有无突变 ) 全部测定出来,所以在跨基 因或者多基因 SNPs 研究中采用直接测序法会使成 本偏高、工作量偏大. 3.3 PCR-SSCP技术 单链构象多态性 (single-strand conformation poly- morphism, SSCP) 是一种利用凝胶电泳分离长度相 同但序列和构象不同的核酸的技术 [10] .1989 年, Orita 等[11] 研究发现,单链 DNA 片段呈复杂的空 间折叠构象,这种立体结构主要是由其内部碱基配 对等分子内相互作用力来维持的,当有一个碱基发 生改变时,会或多或少地影响其空间构象,使构象 发生改变,空间构象有差异的单链 DNA 分子在聚 丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此,通过非变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE),可以非常敏锐地 将构象上有差异的分子分离开,其基本过程是 : (1) PCR 扩增靶 DNA;