PDF《分子人类学中的单核苷酸突变检测方法的研究进展》

(2) 将特异的 PCR 扩增产物变性, 而后快速复性,使之成为具有一定空间结构的单链 DNA 分子 ;

(3) 将适量的单链 DNA 进行非变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳 ;

(4) 通过放射性自显影、银染 或溴化乙锭显色分析结果.若发现单链 DNA 带迁移 率与正常对照的相比发生改变,就可以判定该链构 象发生改变,进而推断该 DNA 片段中有碱基突变. PCR-SSCP 技术简便、快速、灵敏,小于

300 bp 的DNA 片段中的 SNP 检出率达 90%,可以发现靶 DNA 片段中未知位置 SNP,不需要特殊的仪器, 适合临床实验的需要.但要最后确定突变的位置和 类型,还需进一步测序,且电泳条件要求较严格. 另外,由于 SSCP 是依据点突变引起单链 DNA 分 子立体构象的改变来实现电泳分离的,这样就可能 会出现当某些位置的点突变对单链 DNA 分子立体 图1 测序原理图 生命科学 第25卷122 构象的改变不起作用或作用很小时,聚丙烯酰胺凝 胶电泳无法分辨造成漏检.这些都造成 PCR-SSCP 技术在分子人类学中较少应用,而多用于 DNA 研 究中的未知基因突变的检测. 3.4 Taqman探针法 Taqman 探针技术最先由 Polakis 等[12] 于1991 年在 PNAS 上介绍,随后被 ABI 开发广泛应用于 DNA 研究.Taqman 是基于等位基因特异性杂交原 理的 SNP 检测技术,通过检测 PCR 过程中和 PCR 之后产生的荧光信号来区分等位基因类型.它的基 本原理 :PCR 扩增时,在加入一对引物的同时加入 一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两 端分别标记一个荧光发光基团 (reporter dye) 和一个 荧光淬灭基团 (quencher).探针完整时,发光基团 发射的荧光信号被淬灭基团吸收 ;

PCR 扩增时,探 针和模板结合,当forward primer (5'

端的 ) 延伸到 探针结合的地方时,Taq 酶的 5'

→3'

外切酶活性将 探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分 离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号 ( 图2).Taq- man 每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成, 实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同 步[13-15] . 分子人类........