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一了第10卷第4期I995年I2月 中国病毒学VIROLO G I CA sI M C A

6 7 } .

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01 .1 O Nol De e.

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5 Ne s t e d P C R在检测牛 白血病病毒前病毒中的应 用. ( 巾王汉中武汉43007l1'

提要用Ne ~ t c d P C R 检测 牛 白血 病病毒的前 病 毒形 式.从牛白血 病 病毒 基因gpSl上选 择两对引物进 行Ne s t e d P C R 体 外扩 增,产物 经2 a g a r o ~ ~凝胶电泳和 用生 物 素标 记 的探 针 鉴定 , 证 实其 特 异性 . 结果表嘎该 方法 能 从两 个BA T― B L V 细胞内检 澍出BL V的 前病毒 A 形式 煳词 堂嘲酷,一牛白血病 病毒是逆转录病 毒科 的一种致 癌病 毒,在全世界广泛分布 . 该病毒主要感 染淋巴细胞 . 在被牛 白血 病病 毒感 染的牛群 中,大约有 l

2 的牛将发 展成淋 巴细胞增 多症或 者淋 巴瘤.泼病 毒基 因组 由ssRNA 组成 , 分子 量在7 X

1 0

6 至1

0 X

1 o

6 道 尔顿之间 , 病 毒粒子 内含有逆 转录酶,在病 毒复制过程中,病毒基因组经反转 录酶 作用 转录成dsDNA. 该DNA 具有感染性 , 并 能整合 于宿主 细胞 DNA 中,这种病毒 DNA 形式被称作前病毒 由于该 病 毒具有极大 危险性 , 给 畜牧业造成 巨大 损失. 长期 以来 , 世界 各国都在 寻找有 效的检l删方 法.传统的检测方法主要以血清学方 法为主.如放射免疫测定法(R)、EL L S . A、 琼脂糖免疫扩散法(AGI D) 以及 补体结合实验 等.虽然这 些方 法操 作简单,能有效 地检掼I B L V 的感 染,防止 其流行 , 然而这 些方 法也存在着某些不可弥补的局限性 , 例如 :

1 . 在病 毒早期 感染 阶段 能检测 出抗体 ;

2 . 易产 生假阴性 结果 ;

3 . 由于新生小牛能 从母 乳 中获得抗体 , 因此血 清学 方法小能 区别 是被动免疫或主动免疫.本研究的主爱目的是 利用Ne s t e d P C R 技 术直 接检颡}白细胞内的 前病毒DNA , 因此能肯效地 克服血清 学检 测所面临的缺陷 , 提供 了一个安 全、有效 、 快速 的检测方法 . 材料 和 方法 I 细胞培养利用FLK细胞系增殖BLV, 并 以此 被感 巢 的细 胞作为阳性 对照.利用携 带有BLV前病毒DN A 的BAT― B L V 细 胞系 测定 N e s t e d P C R检 测前 病毒 的敏感 性,这两种 细胞 的培 养方 法 见文 献Ⅲ .

2 引物和探针的选择 参照 G e n E MB L d a l 曲a n k ( A c c c s s j o n K o

2 1

2 0 ) 和Sagata 等嘲有关 B L V序列 , 分 奉史于

1 9

9 4 年】1H2

4 日收到 .

1 9

9 5 年3 月6 臼修回大音I;

舒工作 在瑞典 国家兽 医研究 所完成 维普资讯 http://www.cqvip.com

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2 中国病毒学第10卷析资料 . 从BLV基 因组的 e n v - g p S

1 基因区域中选择下列序列作为探针和引物. 引物

1 和2 是一对外部引物 , 弓 物研日 是内 部引物. 选择两对引物之间的一段寡聚核苷酸作为探针l 来检渊产物的特异性. 见表1 . 一,pxLrR , 、 、 . 一305 、 圈l 所示两对 引物在 B L V基 因组 内的位置 Fi g l S c he ma t i c r e pr e s e nt a r i a n o f t h e BLV g c n o mc i n d i c a t i n g t l a c p o s i t i o n o f t h e p l r ~ R l e g I ~ l i r s 衰l 引物的棱苷酸 序列殛 N e s t e d P C R产物的长虞( ) Ta bl e l Nu c l e o t i d c I 】 e n ∞ o ft l a c p r i m c m l 玛日 f o r ne s t e d PC R , a n d ~ n B t l a o f t e xpe c t e d ne s t e d P CR p r o du c t s

3 外闫mi t t 巴细胞 盼 分离 利用Ficall―Paque分 离方 珐从 临 床血 样 中分 离 外周 淋 巴细 胞Ficall-Paquc为 P h a r ma c i a产品.具体操作见产 品说 明4样品 的处 理为了破 坏 细胞 膜,释放核 酸.用两 种 方珐进 行 比较 . A、 酚一氯仿抽 提法.详细 操 作见 Ma n i a ~ i s a X . (