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8 2 ) [ B、 饕 台树 脂处 理法 把0 -

1 ―0 ・

2 B饕 台树 脂【Ph日rma d a产品)同8

0 一l00l细胞悬液 于Ep p c n d o r f 管中,均匀混 台・在匀浆 器上 震荡2

0 秒后 ・ 把样品置 于5

6 ―

6 0 ℃保温

2 吩 钟后 , 再震 荡10秽钟.随后 把样品置 于98℃ 保温l吩钟・再震荡

1 0 秒后,立即把 样 品置 于冰盘 中保 持5 分钟 , -

1 =

1 4

0 0

0 r / mi n离心2分钟,取5一l0l上清 可 直接 进行PCR扩增

5 Ne s t e d P CR体外 扩增在DNA扩增仅(Pcrkin―El me r c c t u s ・ No r wa l k, c T. US A) e e 进行 Ne s t e d P C R扩增第一次扩 增和 第二次扩增 的条 件基 本 一样 扩 增的第 一 阶段 的五 个 循环条 件为;

在8 o ℃热 启动 , 随后9 c变性拈秒 .

4 8 D ( = 退火1 分钟一72Dc延 长1分钟,此后 , 退火温度 为43℃1分钟,而最 后一次循 环 的延 长时 间为

7 分钟 . 整个PcR过 程为32个循环 . 第 一次 扩增 完成 后,从中吸取

5 b .

1 产物 转移 到含 有 ―对 内部 引物 在Eppcndoff管 中进行 第二次扩 增. 二次扩增的反应体积均为5 O l P C R的缓冲液成分见文献Ⅲ. 维普资讯 http://www.cqvip.com 一第4期王汉 中;

Ne s t e d P C K在 检测 牛 白血 病病 毒 的前病 毒 中的 应用3536敏感性 的测定 如图

2 所示t用不舍 镁和 钙的PBS稀 释BAT― B L V 细胞 t 随后 进行 Ne s t e d P C R. 测定 其敏 感性7Ne s t e d P C R 扩增产 物 的鉴 定7.1吸取 l

0 Ne s t e d P C R扩增产物 于2 % a 县ar∞e凝胶 上 电泳 (

2 2

0 V,

2 5 分钟),随后 用溴 化 乙锭 染色 在紫 外灯F观察 结果,根据产 物分 子量 大 小鉴定 结果 .

7 .

2 产物 的特 异 性检 测 采用 S o u t h e r n b l o t 杂 交方法 鉴 定产物 的特 异性 . 利用末端 脱氧 棱糖 核 苷转 移酶于BLV一 特 异性探 针的3末端 标记 B i o t i n 一6-UT P 按照Ma n i a t i s a t B 描述 的方 法进行 S o u t h e r n b l o t . 量量g.图2 N e s t e c l P C R检测 B L V前 病毒 D N A的敏 感性 测定 细胞计 数后 , 按下列 比倒稀 释BAT―BLV细 胞.

20000、2000,200,

20、2十细胞 . F迪2seimi t i v i t y of d e t e c t i o n o f t he n e ~ t e d P CR mo t ho d~. BAT― BLV c e l l s w呲di l ut 甜a9follows :

20 0

0 0.

2 0

0 0,

2 0 0, 20.

2 o=

1 1

8 . 结果INe s t e d P C R检测 B A T― B LV细胞内前病毒 DNA 的敏感 性 细胞计 数后 ( 见图2 ) , 按10倍系列稀释法稀释 B AT B L V 细胞. 结果证 明Ne s t e d P C R扩增 能从仅 含 两个 B AT― B L V 的细胞悬液 中检 测出 B L V 的前病毒 D NA.

2 两种制备DNA 方法的比较采用蛋白酶 K/ 酚抽提法和螯合树 脂处理法制备核 酸( 见图3 ) . 结 果表 明两种方 法都能取 得 满意 结果 , 但螯台树 脂处理法具有操作简单 、 省时 、 经济等优点 .

3 Ne s t e d P CR扩 增产 物的特异性 罔显示出Ne s t e d P C R 扩增产物经2agar0se凝 胶电泳和 溴化乙淀染 色后呈现出一条明显 的预 定带 , 分子量大 小为3

0 5 b p , 和 设计 相 一致 S o u t h e r n b l o t杂 交结 果表明该 产物 是BLV的前病 毒DNA 的特异带 . 维普资讯 http://www.cqvip.com

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1 中国病毒学第10卷400 b p 图4 N e s t e d P C R扩增产物特异性的检测. 产 物经电泳后 , 进行 S o u t h e r n b l o t 杂交.1.阴性 对照(未感染BLV的FLK细胞.2.阳性对照(PAT―BLV细胞).3.标准DNA分子量【100b口DNA l a dd e r.ol b c