PDF《张海的影响》

MCO-15AC 型CO2 培养;

Multiskan MK3 酶标仪, 美国Thermo 公司;

倒Z显微镜, 日本 Olympus 公司;

分析天平, sartorius 公司;

Chromo4 荧光定量 PCR 仪、My Cycler?PCR 仪, 美国 Bio-Rad 公司.

2 方法 2.1 细胞培养 RAW264.7 细胞按常规方法复苏, 培养于含 10%胎牛血清、 青霉素(1*

105 U/L)及链霉素(100 mg/L)的DMEM 高糖培养基中, Z于 37℃、5% CO

2、95%湿度的细胞培养箱中培养. 倒Z显微镜下观察细胞的生长情况, 细胞 贴壁率达到 80%左右传代, 传代三次以上细胞进入对数生长期, 即可用于实验. 2.2 细胞增殖检测 取对数生长期的细胞, 按4*

104 /孔200 μl 接种到

96 孔培养板, Z于 37℃、5% CO

2、95%湿度的培养箱中培 养. 培养过夜后, 加入终浓度为 0.1μM、1μM、10μM、20μM、30μM、50μM 的巴马汀, 同时设Z空白对照组. Z于37 ℃、 5% CO2 的培养箱中继续培养, 细胞培养满 24h 后每孔加入 Alarm-Blue 细胞增殖与活性检测试剂 10?L 并于培养箱中继续培养 2-6h. 当培养基的颜色由靛青蓝变成粉红色后用荧光酶标仪测定各孔相对荧光单位(RF 值), 激发光波长和发射光波长分别设Z为 560nm 和590nm. 根据所测得的 RUF 值计算 RAW264.7 巨噬细胞增 殖抑制率: 细胞增殖抑制率=(1-实验组 RFU 值/空白对照组 RFU 值)* 100% 2.3 巴马汀对 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞生成 IL-6 的影响 取生长状态良好的 RAW264.7 巨噬细胞, 用0.25%胰蛋白酶消化后加含 10% FBS 的无酚红 DMEM 高糖培 养基制成细胞悬液, 并稀释细胞浓度至 5*

105 个/mL 接种到

24 孔培养板, 每孔 1mL, Z于 37℃、5%CO2 的培养 箱中培养. 实验分为巴马汀组, 浓度分别为 1μM 、10μM、30μM;

阳性药 BAY 11-7082 组, 浓度为 10μM, 同时设Z LPS 组(LPS: 1μg/mL)和空白对照组. 细胞融合后, 以上各组除 LPS 组和空白对照组外均先加入相应的药物预处 理1h, 然后各组加入 1μg/mL 的LPS, 空白对照组加入相同体积的 DMSO, Z于培养箱中培养 24h 后取细胞培养 上清液, 按试剂盒说明操作, 用酶标仪于 450nm 波长测定吸光度值. 2.4 巴马汀对 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞 IL-6 mRNA 表达的影响 细胞悬液稀释至 1*

106 个/mL, 2mL/孔接种至

6 孔培养板. 细胞融合后, 各组加入相应药物孵育 1h, 然后除 空白对照组外, 各组加入 1μg/mL 的LPS, 于培养箱中培养 24h 后终止培养. TRIzol 试剂提取细胞总 RNA, 紫外 分光光度计在 260nm 波长处测定 RNA 浓度. 以Oligo(dT)18 为引物, 用SuperScript III 逆转录酶将新提取的等量 细胞总 RNA 逆转录为 cDNA. 以cDNA 为模板, 用SsoFastTM EvaGreen? SuperMix 荧光定量反应试剂盒进行定 量PCR 反应, 以GAPDH 为内参. 荧光定量 PCR 所用引物见表 1. 表1荧光定量 PCR 所用引物序列 Tab.1 Primers of qRT-PCR 基因名称 引物序列 IL-6 forward 5' TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG 3' IL-6 reverse 5' TCTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC 3' GAPDH forward 5' AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG 3' GAPDH reverse 5' CCTGGAAGATGGTGATGGGAT 3' 2.5 统计学处理 采用SPSS18.0 统计软件进行统计分析. 组间差异比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA), 方差齐者 采用LSD 检验, 方差不齐者采用Tamhane?s T2 检验, 数据以均数± 标准差(x _ ± s)表示, 以p