PDF《堕全查 严明 鲁晓道 邱定红》

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0 0 0转/分离心 5分钟 ・ 取 上清液 , 加0.6倍体积的异丙酵 . 离心后的沉淀溶于

5 O 山的 n: 中. '

P C R扩增 第一次 P C R反应 : 在0.5ml的Epp.r.dorf管中依庆加入 P C R匣应缓冲液和终浓I 蔓为20m'

,l/L的 d A T P 、 d G T P 、 d C T P . 椰 加入套) l '

q l 物 C和 D. 每条引物的最终浓度

0 .

5 ~ m o l / L , 取样品 D N A约一加2个 位的TaqD N^ 多聚酶 , 加水 到总 体积 为51.I - . 面疆 盖5I的石 蜡油.反 应条 件为:94℃变 性35秒 ,

6 0 C 遢火

3 0 秒,72℃延仲4

5 秒.反应

3 5个循环. 取第一次 P C R反应产物

2 . 在一新的

0 .

5 m l 的Eppcadorf管中.同样的条件再 用套 山引物 A和 B进行 第二 扶PCR反应 , 反应20个循环

5 特异性和敏感性试验 以HOA V - D N A探针为摸板 . 按l0倍梯度稀释 成以下浓I 蔓: 从l0崛到l0 嵋/ . 从每个稀释管中取 l 用于 P C R检测 , 先采用套外弓 f 物 C和 D或套 引物 A和 B进行 一P C R扩增 , 然后 取经 C和 D引物扩增后的单一 P C R产物

2 , 再用套内弓 f 物 A和 B在相同条件下进行套式 P C R反应. B P C R产物的检测 取1O山的 P C R扩增产物, 在2%的琼脂糖凝腔l

1 I 进行电泳 . 以演化己锭染也 . 在紫外灯 下观察 和照 相. 结果1病人中 H C M V ― P C R结果 附表是 所有被检病例 的PCR结 果.当采用单一 P C R方法时 , 在 所检查 的6l倒病 人中 . 有33例 为HC MV阳性 , 占所检测病 人的

5 4 . I ;

而 采用套式 P C R后.育47例表现 为HCMV阳性 , 阳性检 出率 为77.0.图1是部分病 饲的 H C M'

V 一 套式 P C R( +) 的 电泳结 果. 可见这些病例 与阳性对照一致 , 均出现了

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6 b p的扩 增带 .阴性对照是 无HCMV病 毒感 染的 人胚肺体 外培养的细跑 , P C R反应后 无带型出现 .

2 HC MV― P C R敏 感性 与特异性结果 图 2是单一 P C R与套 式PCR敏感 性与特异性试验 及其比较结果 . 所用模板为不同稀释度的

1 .

9 5 k b的HCMV探针 D N A( 由英固 S i n d a r 博士惠赠) , 位于 H C MV立即早基 因( E a r l yi mm e d i a t e g s n s ) 区 .罔

2 A是 用引物 C和 D进 行单 一RCR的扩 增结果 , 网2B是 甩引物 A 和 B在 同一条 件下进行单一 P C R反应 的结 果,罔2c是将 C ― D单一 P C R的扩 增产物再 用引物 A和 B进行套 式PCR的扩增结果 . 可见 . C ― D或A―B单一 P C R均可检测出

1 0 -

9 u g即】fg的 H C MV― DNA, 敏感性 已很高 , 但套 式PCR能检测 出5*1

0 f g的HCMV 探刳. D N A, 相当于

2 ~3个靶 序列 , 比单一 P C R鬻高 出100倍以卜. 此外 , 从罔 中可 见. P C R反应只出现

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2 b p或146bp的 H C MV特 异性 DN A 片段 . 无其 它非特异性带 型出现 , 显 示了 P C R 技术的高 度敏感性及所用引钩的高度特异性 . 襄6Hk-WI V 一 单一和套式 P C R结果的比较 T a b l e O哪阻曲nofre曲曲掘in6l c ~l d r c a i ~t i e ms wi l h n ~ o n a t s i b , c pa t i t i ~时B-andnc~lcd-PCR维普资讯 http://www.cqvip.com 第2期单祥年等 : 套式 P C R检测婴幼儿巨纽胞病毒感染

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7 圈1部分 曼JL肝炎综 台征患儿 的套式 P ( 检 结果 . M, p O E M一7ZL―DNA(~) / № e

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1 分 于量 标准IV:HcMV阳性 对照Ic阴性 对照 . 无HOVlV蒜染的体外培养的^胚肺细胞 l

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6 t ~示HCMV―DNA扩增片段. F

1 N e s t ~ l P ( R ~ i c a t i o n o f HC MV― D NA i n∞m ~ a s c a wi 【 h r : ~ o n a t a l h e p a I . M } p GE M一7zf(+)DNA / Ha e1