PDF《吴东,王 华林 ,邓菲,陈新文,彭辉 银 ,胡 志 红料》

原核表达载体pProEXHT b为GI B C O B R L 公司产品.含Ha S ― N P V几丁质酶基因的基因组文库质粒pCXW125由本 室构 建[13].1.1.2棉铃虫细胞系Hz AM1 【

1 4 ] 由本 室保存;

Gr a c e s 昆虫 细胞 培 养基 和胎牛血清为GI B C O B RL 公司产品.棉铃虫单核衣壳核多角体病毒 G 4株分 离于湖北 省罹病幼虫【 ] .

1 .

1 .

3 P C R引物 由上海 S a n g o n生物技 术公 司合 成.1.1.4酶及试剂各种工具酶购自日本 T a Ka R a ( 大连)生物工程公司.T a q酶为加拿大Biostar公司产品.l k b D NA L a d d e r 购自GI B C O B R L公司.蛋白质分子量标准购于Ne w E n g l a n d B i o L a b s . G l a s s mi l k凝胶回收试剂盒为加拿大BioStar产品.IPTG( 异丙基一 ― D 一硫代半乳糖苷)为Prome g a公司产品.抗几丁质酶抗体 由英 国剑桥病毒学与环境微 生物 学研究所 ( Na t u r a l E n v i r o n me n t R e s e a r c h C o u n ― c i l ) 的RobertD. P o s s e e 教授 惠赠.碱 性磷 酸 酶标 记 的羊 抗豚 鼠二抗 购于Sigma 公司. 碱性 磷 酸酶 显色试剂 盒 购于 华美 公司.1.2方法

1 .

2 .

1 重组表达载 体 的构 建选择含Ha S NP V 几 丁质 酶基 因的文 库质 粒pCXW1

2 5为模 版,根据 Ha S N P V几丁质酶基 因的序列, 设计 一对 引物, 删除N端

2 0个氨基酸 的信号肽和 C端 4个氨基酸的 内质 网 定位 序列 . 引物序列 如下 : 上游引物:5 G GG GG A TC C G C TC C A C C C G― G C GT T C C C -

3 .5 端含 有BamH I 位点, 后18nt与Ha S NP V 基 因组

3 7

3 3

3 n t 一37350nt互补 ;

下游引物:

5 G G G C T G C A G I V I '

A I A A T c A A T C T A C T GT T TG TA C C -

3 ,5端含有PstI位 点,后21nt位于-Ha S NP V 基 因组

3 5

7 1

3 n t 一3

5 7

3 3 n t . P C R反 应条件为 :

9 4 ℃预变性

5 mi n ;

9 4 ℃

4 5 s .

5 5 ℃

4 5 s ,

7 2 ℃

9 0 s 为 一个 循环,进行30个 循环;

最后72℃延伸5mi n . 反应产物用1%琼 脂糖凝胶电泳鉴定,Gl a s s mi l k凝胶回收 纯化试剂盒回收和纯 化PCR产 物,用BamH I 和￡I 酶切,再次回收 , 与 同样处理的 p UC

1 9质粒连接.连接产物转化大肠 杆菌,挑白斑,酶切鉴定阳性克隆子,命名为pUC

1 9 / C h i A. 利用pUC

1 9通用引物对pUC

1 9 / C h i A进行测序, 序列比较显示扩增 的片断与........