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一z第9卷第3期1994年 9月旰膨中国病毒VI R0L0G I cA S Ⅱ CA g Q ) No.

3 S e p .

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4 H B V - D N A的P C R 二步法扩增及其快速检测 .武及

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7 1 ) 关键词H B V . . h , = 步温控PcR.s阻uh鲫杂 交.生物索寡聚核苷酸杂交停-一乙型肝 炎是 危害人类健康 的主要疾病 之一 . 其病原 常用 的检 测方法 多采甩血 清学技 术,由于核酸杂交法在检 测具有增殖活力 H B V上的直接性和 可掌性 日益显 示其重要性 , 但 经典杂 交法 ( D o t b l o t 和South~nblot)的固有缺陷 除耗时繁镇外 , 更为 突出的是灵敏度较差 , 只俄 检测 出P窟水平左 右的核酸 , 故远不能满足 实际上的需要 .已能克服灵敏 度不足 之PCR技术[ 多以 三步怯进行 , 本 文采用 P CR二步法 [

2 ] 进行 H B V - D NA扩增 . 井就其特 异性 、 灵敏度进行 了实验 . 获得满意结果 , 加之与生物索标记 寡聚核苷酸杂交法踟相结合 . 从而提供 了一 十特 异、灵敏 、 快速、简便的 H B V ・ DN A检测 系统 , 现将实验结果报告如下 : 材料与方法

1 H B V - D N A的制 备 克隆于大肠杆菌 H B I O

1 巾的 H B V - D N A重组质粒, 通过小量碱法Ⅲ进行抽提、 样品纯化 后・经BcoRI(华美生物 工程 公司产 品) 酶切 . 低熔 点琼脂 糖凝腔 电诛 回收 H B V ・ D NA片段 .

2 H B V ~ D N A探针的制备 采用缺 口平移法Ⅲ对纯化 H I ~ / - D N A分子进行标记 . 反应中所用 a - P d C F P为北 京亚辉生物工程公司产品. 生物素标记寡聚核苷酸探针由上海细胞生物学研究所代为台成 .

3 血清中 H B V - D N A的制备 血清中 H B V - D N A的提取参照 S h u i c ~ k . 踟等方法并略 加改进. ' P C R反应 系统 P C R反应 所 用二引物 由上 海细 胞生 物学研 究所 代为 合成 , 其= 步法 参照文 咖方法 进行 . T a q D NA聚台 酶赡 于上 海复 华生 物技术 公司 . I P C R产物分折 P C R扩增产物在 I A B a r ( 鼬 凝胶电泳分析基础上 , 然后采用分子杂交技术 作进一步鉴 定.结果与讨论 I 三步及二 步温控 P C R扩增特异性 研究 以100pgHBV-DNA及

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0 p g 一DNA为模板 , 同时进行三步及 二步温控 P C R扩增 , A g a r

0 s e 凝胶 电泳结果 见图la.该结果表 明,两种反应条件下 , H B V - D N A都能大 量扩增 , 而对应 的一DNA却不能进行扩增 , 并 且该 H B V - D N A二种扩增 产物 在1Ass.rose凝胶 电- I j : 中的迁移率完 全相 同 .通过分 子 量标 准测 得该 P C R产 物分子 量与理 论推 导数值 一致 , 经 P标记 的HBV―DNA探针与扩增产物进一步杂交结果 ( 见图ib)表明该扩增产物为 H B V― D N A特异序列 . ・本文

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5 3 年 5月 ¨ 目收到 、 I

1 月4H信回 维普资讯 http://www.cqvip.com

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2 中国病毒学第9卷 阻lI%A~ms e凝腔电诛 分析HBV- DN A 三步及二步PCR扩 增产物【n)及Soumc r n b l o l 杂交(b)结果注M_ p a r 瑙H e a I片段作分子置标准.1 . 三步 P C R扩增 产物 乞二步 P C R扩增产物

3 . 阴性对照( k - D N A为 模板1 F 】 _ Tn c r c s u l l s o f啪mm a n d t wo - l c r c t p c r a t t t r ~ P cR a mp l i f ~ a h HBV- DNA b y a g a r o s e - El }A na l y ~ " )a n d So u g a ~ r n Bl o f Hy b r k ! i z a f io f l( b ). N0 妇:ICL呻 R黜}~a l p n e n t s墨矾如山 We i g h t蛐Irk甘. 】 .Am p l i ~ i c a1 ~ al WO d U g t s t b r e c - s ~ e pP cR. Z Amp i L C i c a t i o n o ft wo - ~~ p ・