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3 .N c o n l r d ( g - I ~ N A ∞ r e mo t e )

2 琼脂糖凝胶电泳 及生物素寡聚核苷酸 杂交对 H B V - D N A的二步 P C R扩 增灵 敏度 、 特异性测 定 将不同稀释度 (

5 a g 一5

0 0 p g ) 的模板 D NA通 过二 步温度 控制 法进 行PCR扩增 , 然后通 过IAgarose凝胶 电泳检测扩增产物 , 结果如图

2 a 所示 , 该 结果表 明.二步温度控 制法 P C R扩增 及琼脂糖凝胶 电泳检测扩增产 物,灵敏度可达

5 0 a g . 取21二步 P C R扩增产物( 模板浓度分别为

5 f g 、

5 0

0 a

8 、

5 0 a

8 、

5 a

8 ) 经碱变性后直接点于硝 酸纤维 素滤膜上 , 然后 与生物 素标记寡聚核苷 酸探针 杂交 , 经显 色后 可见 上述扩增产物 都能 与 该探针杂交 , 而 对照 ^ 一DNA无杂交点 出现 ( 见图

3 b ) , 该结果说 明使用 上述 生物索寡聚核苷 酸探针完全 能快速 、 准确地鉴定出 HB V― DNA特异性 扩增产 物,而二步 P C R法与 生物 素寡 聚桉 苷酸杂交相结合可检 测大 约I一2 个HBV―DNA分子 . I 维普资讯 http://www.cqvip.com 第3期方勤等 : H B V - D N A的PCR二步法扩增及其快速检涮

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3 图2・ 唧V―DNA的二步 P c R扩增灵敏度, 特异性琼脂禧凝脏 电泳厦生物翥寡聚援苷酸杂交撕 洼t札邮"/陆-为分子量标准. 且.1--5 分剐以

5 0

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5 0 、

5 嗥HBV-DINA为横板 山l一4分别以

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0 ~ a g ・

5 、

5 a g I - I B V - D N A为模扳经 P E R扩增与 生物翥寡聚援苷酸杂交结果 .5为阴性对照 DNA) .

2 = e mi l i v i l y,s p e c i f ic f ly= ~ s a yd HBV- DI N A d e t e c t l o n PCR s t a i n e d a g a r c e e s e t a n d b i o t i n y l a | e d~ t ~ S o n u - ~ l e o t i d e h me t h o d . N o t e s M l p 卫R3

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4 中国病毒学第9卷圈3血情中 H B V ― I A x l A的I ' C R扩增琼脂糖凝腔电沫及 生物素寡象校苷酸袭变结果 蛙.P.,为克 隆株HIPg-IAXlA阳性 对照N|为DNA胡性对照

3 m ¨ PC R a m p l ~kat i o . d HBV一^in卿_岫lagaroseselandt/o~ny l a t e d d m ~ / o o t i d e h y b 血∞t i 帅Nd t 蕾P1 DI p ~ l i / t i v ~ 蚶_lN1 b I I c 脚o0ntrol^1 一,Bl 一,C1 一serum鞠Dknumb e r

3 P C R二步法扩增及生物素寡聚核苷酸 探针杂交 用于血清 样品 的诊断 本实验通 过对

1 8 份血清 样品( 由市传染病院提供 ) 进行 F , . S R二步法 扩增 经琼 脂糖凝胶 电 泳及生物索 寡聚核苷酸探针杂交 , 所得结果 见图

3 . 结果显示 , 经PCR二步法 扩增 的18份血清 样品,其中16份出现特性扩增带 , 且在 l Ag a r o s ~凝胶 电泳 中的迁 移率与标准克隆 H B V ― D N A 分子扩增产物带完全吻合 . 对照 / - DN A未见扩增 带出现 .将 上述 扩增 产物 与生物素标记寡聚 核苷酸探针进行点杂交 , 结果表示 . 上述 l

6 份 阳性 样品全 部能与该探针杂交 .另外 的样 品c6在Agar~se屯泳时未出现扩增带 , 而杂交时 出现杂交点 . 迄今病毒性疾病的诊断主要依赖免疫学 、 细胞学 、 分子 杂交方 法等.P C R的问 世,不仅为 病 毒检测提供 了准确方便 的手段 , 而 且使 临床诊 断更趋完善和 简化 , 其灵敏 度是一 般 核酸分 子杂交所 不及 的.在HBV-DN A实际检测 应用 中,核酸杂交法 检袒