编辑: liubingb | 2016-08-29 |
0 ℃ 下备 用.2.提纯病毒粒 体 形态 观察:按常规方法制样. 钶网沾职提纯病毒 液 .蒸 馏水 冲 洗后 用 2嘶钼 酸铵 染色,干 后 电镜 观察3.提纯病 毒紫外吸收特性:提 纯病 毒适当稀 释后 的 日立
2 0
0 ・z 0紫外分光光度计 上扫 描测定,扫 摧范围3
0 0 - -2
3 0 n m,根据该病毒吸光 系数 E} : 品0 .
1 嘶值为2 .
7 1 ¨l ,来估算病毒 浓度.
4 . 提纯病毒活性 捡删:将提 纯病毒以常规摩擦法和蚜 虫薄 膜饲毒 接种温室 繁殖的惑宿 品种 黄早四的 三叶期健苗,2 S ℃条件下7 一加天观察叶片 症状. s . 病毒外壳 蛋 白的 S DS - 聚 丙埔 酰胺 凝胶 电泳:采 用LaemmI i 不连续电泳 系统l I ¨, 分离胶浓度为
1 2 .
5 师 ,浓 缩胶 为4嘶,稳压200V, 电诗: 3小时 ,考马斯亮蓝染色. 三 、抗 血清镧备及 酒定:选用体重约3公 斤的北京大耳 白兔. 前=敬用 提纯病毒与不 完 全佐 剂 (美 国DI E I C O 产品 )的乳化液 进行 肌 南多 点 注射 , 后 二次 用提纯病毒直 接耳 静脉注射,免疫总量为
1 .
5 mg提纯病毒,末 次免 疫后
1 s 最一 次性采血 清,分离血 请 .血 清 加叠 氮 化钠 至0.1,-20~G下保存备用. 用微量玩淀法 . S D S琼脂双扩散珐及间接E L I S A 法剥定抗血清的效价和特异性.
四、 阃接 E L I S A实验:用硫 酸铵沉淀法从抗 血清牢提取免疫球 蛋白,进行 常规ELlSA实 结果固1提纯 病毒的 电镜用 片(*3
0 0
0 0) F i E
1 E l e c t r
0 n mi c r o g p h D f p u r i f i t d i r n (x
3 0
0 0 )
一、病毒 提纯及其特性1.感病叶汁液经提纯 ,在蔗糖硫酸铯不连续 密度梯度 离心 后 的离心管中部有一 明显可 见的 乳白色病 毒带.提纯病毒 摩擦 接 种健 苗后,健苗的发病率达64%,表明本法提纯 的病毒 具较 高的侵 染性 , 但用麦二叉蚜 ( S c h i z a p h i s g r a m/ h u m) 、 玉米蚜 ( Rh o p a l o s i - p h u m ma i d i s ) 、麦长管蚜(Ma - c r o s i p h u m e v e n a ~)三种蚜虫薄膜饲毒 ,共 接种健 苗104株,均未发病.2.提纯 病毒电镜 下观察,可见大量 毁状 病毒 粒体 ( 图1) , 宽度为
1 4 r i m, 长度不 等, 但多为720--750nm, 与 国内外报道 维普资讯 http://www.cqvip.com 第1期陈剐等:玉米矮花叶扁毒提纯殛特性的研究
9 5 相近'
一 .
3 . 提 纯病毒的紫外吸收 ( 图2) 呈 典型含 约6%梭 酸的鳗状 病毒吸收特性,最大吸 收在
2 5
8 - -2
6 2 a m之间,最小吸 收为
2 4
2 n m左右 , A Ⅲ / A 为0.63―0 .
8 O , Ama z / Aml n 为1.15,均与国外 报道 基本相符 】 . 根据病毒 在260nm处的光 吸收值,估计提纯病毒的产量 为0.7―1.2mg /
1 0
0 g 病叶. D C B A 被长(nm) 圈2提纯 病毒紫 外吸收 曲线 图3提纯 病毒 的$DS聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳 图Fi g
2 ¨ t … a 【 e t Ah s D l i …
0 f 注:A: 标准蛋 白;
B和c:提纯病 毒;
D:建 叶提取 物, Fi g
3 S DS― PACE o f pu T l f i d Ti u p pa r at i o u P 川…PF… N o A{ M … k r .;
B: a n d C: Pu r i f i e d Ti r us D: Pa r i f i ed p P
0 r t i oⅡ f r oI 口be ・ I t l a p I ・ nt
4 . 提纯病毒经SDS一聚丙 烯酰胺凝胶电泳 考马斯亮蓝染色后 , 可 见一 条明显的蛋白带 , 分子量为36000道尔顿,与国外报道相近(图
3 ) .
二、抗血清制备提纯病毒 免疫家免获得 的抗 血清 经微 量沉淀反应测 定,效价 为1/2048,用SDS 一璩脂双扩 散和间接 E L I S A法检 测(表1) , 该血清只与病 叶汁液 和提纯病毒 有反应 , 而与裹1抗血清 的, . 异性 潮 定一 目攮 E LI S A涪Ta b【 e