PDF《黄亚东,郑 青 ,王 林川2,李校垄料,黄 自然 3》

2 1 d中进行研究, 为进一步研制和开发IBV 基因工程疫苗奠定 基础.1材料与方法1.1病毒 肾病 变型IBV广东分 离株GD05和 标准 毒株M4 1由华 南 农业 大学禽病 室提供.1.2寡核苷酸 引物 根据已报 道[3]的IBVBeaudette株 S1基因序收稿 日期 :

2 0

0 1 .

1 2 ―

2 9 , 修回日期 :

2 0

0 2 .

0 3 ―

1 1 基金项 目:广东省 青年基 金资助 (

9 5

0 4

1 6 ) ;

国家自然科 学基 金资助 (

3 9

4 7

0 5

3 8 ) 作者 简介 : 黄亚 东(1971.),男.博士.讲师 .研 究方 向为 生化化 学及 分子 生物学 . 料 通讯 作者 : 李 校望 (

1 9

6 4 . ) . 男,博士 , 副教授 , 研 究方 向 为生物 工程 .C o r r e s p o n d e n c e a u t h o r 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 3期 黄亚东等 : I B V广 东分 离侏GD

0 5 S1 基 因的 克隆 、 鉴定 及其 表达267列设计PCR引物P1(5CG C GAA TTC A GA― GATGTTGGTAA 3) 和P2(

5 GACGGATCCTAA― C AT AAGGG C AA

3 ) , 由上海生物工程公司合成.为了克隆的方便,引物P1的

5 端引入了EcoRI酶切位点,引物 P 2的5端引入了BamHI酶切点.1.3病毒 增殖 及RN A提取病毒RNA 的提取和RT―P C R 参照Binns和 王林 川等 方法作改进[,.反应产物作1.0%琼脂糖凝胶电泳 分析.1.4RT―P C R 产物的酶切分析将IBVGD

0 5株及M4 1毒株的PCR产物分别用BstYI,Ha e I I I 和RfI进行酶切后,在2%琼脂糖凝胶(含EB) 上 电泳 后紫外检测.1.5IBVGD0 5株s1基 因的克 隆及全序 列分析 参照pGEM ―T E a s y s y s t e ml I KI T 说明书进行.用M1 3通用引物在ABI P RI S M M

3 7

7 自动 测序仪上进行序列分析.1.6IBVGD

0 5株s1基 因表达载体 的构建及表达 参照文献【J进行.2结果2.1IBVGD

0 5株sl基 因的PCR扩增IBVGD

0 5株,M4 1株经RT―P C R 扩增后电泳分析表明二者均扩增得到了约

1 .

6 5 k b的片段,与预期结果一致.2.2PCR产物酶切分析分别用Bs t Y I , Ha e I I I和Ps t I 对IBVGD

0 5 株与M4 1株RT―P CR产物进行酶切分析,结果表明IBVGD

0 5株S1基因PCR产物经BstYI酶切得到1.0kb和

0 .

6 5 k b两个片段 , 经Ha e I I I 酶切得到0.9kb、0.

4 k b和0.35kb三 个片段,经PstI酶切得到0.56和

1 .

0 9 k b二个片段.IBVGD

0 5株与M4 1株S1基因PCR产物酶切结果完全一致,按Kwo n等[]的PCR/ RF L P 分型方法,可判定IBVGD

0 5株属 于Ma s s血清型,结果见图1.2.3IBVGD

0 5株S1基因的克隆IBVGD

0 5株S1基因PCR产物与pGE M ―T E a s y载体连接后转化E. c o l i J M1

0 9 , 在筛选平板上挑取多个白色 单菌落,小量提取质粒EcoRI酶切分析电泳 检测,经筛选获得阳性重组子pGE MG DS

5 . 重组质粒 p G EMG DS 5的鉴定结果见图2.图lIBVGD

0 5 Sl 基因的RT―P C R产物 的酶 切分 析Fi g.

1 Re s t r ic t i on e n z y m e d i g e s t i o n of RT ― P CR o f I BV GD05 Sl gene L a n e l ,

2 5

0 b pDNA Ma r k e r ;

2 . M4

1 S l / RT―P C R p r o d u c t / Bs t Y I ;

3 , GD

0 5 S

1 / RT ―P C R p r o d u c t / Bs t Y I ;

4 . M

4 1 S

1 / RT ―P C R p r o d u c t / Ha e I I I :

5 , GD0

5 S

1 / RT ― P C R p r o d u c t / Ha e I I I ;

6, M

4 1 S l / RT ― P C R p r o d u c t / ￡ I :

7 , GD

0 5 S

1 / R T ― P C R p r o d u c t / P s t I ;

8 , GD

0 5 S l / RT―P C R p r o d u c t ;

9 、 X DNA / H/ n d I I I . b p l 皇图2重组质粒pGE MGDS 5的酶切及PCR鉴定结果Fi g.

2 Re s t r ic t i o n En z y me Di ge s t i o n a n d PCR o f Re c o mbi n a n t p l a s mi d p G EM GDS5 L a n e