PDF《武汉大》

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0 、 修回日期 :

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9 9 ―0 4―0

5 ÷ 国豪自然科学基金和国豪教叠博士点基金资助 料 通讯 作者 : 齐 义群 ( I

7 一】 . 男. 教授. 博士 导师 . 主要从 事分子 捕毒 学 研究 华中师 范大 学 生命科学 院96级研 究生 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 1期 齐 义鹅 等:家蚕核型 多 角体 病 毒中 国株 和 日本 株vp39基 因的比较 研究531材料与方 法11试{l|.质粒 及菌株限制性 内切 酶.T4DNA连接酶,Ta q DN A 聚合酶.SIVE R ― S E QUENC E T M 等购自Pmme g a公司和华美生物技术 公司.B mNPV中 国分 离物由南京军区军事 医学 研 究所 邓小昭博士赠送.质 粒pGEM3 ~. 表达质粒pRSET―A. 大肠杆菌 TGI和BL21等 由本 室保存 .

1 .

2 病毒 D NA的提 取用BmNP V― C h感 染家 蚕细 胞.当50%左右 的细 胞 中形 成多角体 后.2000r,rai n离心除去细胞 .

4 0

0 0

0 g 离心40rai n收集病毒粒子 .加 入蛋 白酶 K( 终 浓度

1 0 0~ g / mL ) 和1%S D S裂解 病 毒粒 子.释放DNA. 接常 规 方法 以酚 、 氯仿抽提 . 乙 醇沉 淀DNA. I .

3 重组 质粒的构 建和 筛选参照AeNP V v p

3 9基因序刊设计 P C R 引物 . 正 向引 物P1:GCCG GA TC CA AC AA TATG GCG C TAG T;

反向引钧 F

2 AA TC TTG C GT. 以BmN P V― ChDN A 为模板 扩增回收 P C R产物.并克 隆到 p G EM3 z : [ 中. 转化 大肠杆菌TG1 , 加入x― g a l / I P TG 诱导.经兰自斑 筛选,得到阳性 重组质粒pGEM一39.经BamHl / Ec o R1酶切 重组 质粒pGE M一39DNA. 回收 小 片最 . 将其插入到原核表达 载体pRSET― A 中.构建重组表达 质粒pRSET-

3 9 .质粒DNA的 制备 、 酶切、连接 和 转化 按 文献 【

7 ] 进行 . I .

4 B mNP V

1 .

3 k b P CR片段 的序 列 测定 大量 制备 重 组质 粒pGEM.

3 9 , 并经PEGS000纯化 后.用ddNP W P C R / 银染 涮序法.参 照文献【8]和试 剂 盘说 明书 测定

3、5两侧末端 序列, 垒序 刊测定由加拿 大GendBTechCo.完成.1.5vp39基 园 的同 薄性比较 及推 导 的囊晨 蛋白的二级 结构分析 采用 DNA S

1 S软件和PRO S I S软件分析 B mNP V- C h与 日本 株BmNP V- J s v p

3 9基因的序 列和 氨基酸同源 性 .分 析两株病 毒VP

3 9蛋 白的 亲疏 水性 、 酸碱 性和 二 级结 构 并进 行详 细 比较 研究.

2 结果2.1BmNP V - C h

1 .

3 k b片段的克隆 及序列测定 根据 我们_

9 以前的报道, 将BmN P V. C h -1 .

3 k b的PCR扩 增 片段 定 向克 隆到 p G E M3 Z f 的BamHI / S a e I 位点, 阳性重 组质粒 命名为pGEM-

3 9 . 用于 序 列测 定. 同 时用 B a mHI / E∞RI 回收 P C R片段 . 亚 克隆到 表达 质粒 p R S E T - A 的 同一 位点 . 构建表达 载体 p R S E T-

3 9 ( 图1).用双脱氧末端 终止法测 定了pGEM一39中 P C R片段 的序列 , 发现一长 l

0 5

3 b p的0I ( 该 序列 已储存美 国GenBank,编号 : AF

0 6

3 1

0 4 ) .

2 .

2 B mNP V - C h

1 .

3 k b片段 的序列及其 同BmNP V . J a v p

3 9基因 的比较 图 2是 B mNP V. C h v p

3 9与BmNP V- J a v p

3 9基因序列 _

6 的 比较, 它们 的核 苷酸 同源 性达

9 7 .

5 %.证 明此 OR F应为 B mNP V- C h的vp39基 因, 它比BmNP V. J a v p

3 9基 因序列 长9bp,其中第

6 2

5 - -6

2 7位增加了 C GA.

9 8

5 ~9

9 0位 增加 了GT C C . W _ ~ .表明 B mNP V- C h v p

3 9基因有两处插 入突变 , 插 入碱基分 别是