PDF《一,夏成柱 ,胡桂 学2,谢之景 1》

1 i n e . a n d v e r i f ie d t h a t i t wa s a s t r a in o f CCV b y RT - P CR a n d s e q u e n c i n g . Ho we v e r , s o f a r , n o o n e h a d s e q u e n c e d t h e c o mp l e t e s p i k e( S ) g e n e o f g i a n t p a n d a '

s i s o l a t e o f CCV . I n o r d e r t o s t u d y t h e n o v e l m o l e c u l a r b i o l o g i c a l c h a r a c t e r is t i c s o f g i a n t p a n d a '

s i s o l a t e a n d r e l a t i o n s h i p s wi t h o t he r s t r a in s o f CCV t he f o l l o wi n g e x p e r i me n t s h a v e b e e n c a r r i e d o u t .

1 M a t e r i a l s a n d M e t ho d s

1 .

1 CC V g i a n t p a n d a '

s i s o l a t e( s t r a i n DX MV) Th e s t ra i n DXM V wa s i s o l a t e d f ro m t he l i v e r o f a n a c u t e l y d i e d g i a n t p a n d a wi t h f e l i n e k id n e y CRF K c e l l l i n e b y t he c ul t u r e o f mo no l a y e r c e l l a n d a da pt a ― t i o n o f c o n t i n u o u s p a s s a g e s , wh i c h h a d b e e n i d e n t i f ie d b y c o n v e n t i o n a l me t h o d s , RT - P CR a n d s e q u e n c i n g .

1 .

2 M a i n r e a g e n t s M ― M LV,RN a s i n , T4 DNA l i ga s e a n d d NTPs we r e pu r c ha s e d f rom M BI c ompa n y .RNA Ex t ra c t i on k it wa s f r o m QI AGE N c o mp a ny .T a q p l u s D NA p o l y me r a s e , DNA g e l e x t ra c t i o n k it we r e g a i n e d f ro m S h a n g h a i b i o t e c h n O l o g i c a l Co . L t d .p GE M ― T v e c t o r f ro m Pr o me ga c ompa n y.Res t r i c t i o n e n do n uc l e a s e s a n d o t h e r r e g e n t s we r e o b t a in e d f r o m T a k a r a Co . Lt d.

1 .

3 S p e c i f ic p r i me r s Ac c o r d i n g t o s p i k e g e n e s e q u e n c e o f CCV s t ra in V5

4 r e p o r te d b y Ge n Ba n k , a p a ir o f s p e c i f ic p r im e r s wa s d e s i g n e d a n d u s e d t o a m p l i f y S g e n e o f s t ra i n DXM V.Up s t re a m p r i me r :5 '

一CAGGTACCACCAT G AI TG I '

GCTI

1 ACAI I '

G, r GCC-

3 '

: Do wn s t r e a m p r ime r :

5 '

一GAAc I T r 1TGAA TT CAGTGAAC A TGA一3'

.I n o r d e r t o f u r t h e r c l o n e .r p n I a n d No t I s i t e s we r e a d d e d i n t h e

5 '

e n d o f u p s t r e a m a n d d o wn s ― t r e a m p r ime r s , r e s p e c t i v e l y .

1 .

4 l s o l a t i o n o f t o t a l RNA S t ra in DXM V wa s c u l t i v a t e d i n mo n o l a y e r c e l l O f CRF K. W h e n c e l l s a p p e a re d c y t o p a t h i c e f f e c t . t h e c u l t ur e wa s h a rve s t e d a n d us e d t o i s o l a t e t h e t o t a l RNA.RNA Ext r a c t i o n k it wa s us e d a s d e s c r i b e d a s t h e k it i n s t r u c t i o n o f me n u t o i s o l a t e t o t a l RNA. T h e i s o l a t e d RNA wa s f in a l l y d i s s o l v e d i n

2 0 p L R N a s e ― f re ewa t e r .

1 .

5 Re v e r s e t r a n s c r i p t i o n a n d P CR a m p l i f ic a t i o n Re v e r s e t ra n s c r ip t wa s c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o t h e r e f e r e n c e [

7 ] .P C R v o l u me wa s

5 0 p L wi t h R T p r o d u c t

2 B L ,1 0* P CR b u f fe r

5 B L ,

2 5 m mo l / L M g C1

2 4pL,25 pmo L u ps t r e a m p r ime r l pL,d owns t r e a m p r ime r l p L,

2 .

5 mmo l / L d NTP s

4 p L, H2

0 3

2 .

7 p L a n d

5 U/ l a L T a q p l u s p o l y me r a s e

0 .

3 L_T h e c o n d i t i o n o f P CR r e a c t i o n wa s a s f o l l o ws :

9 6 ℃,

2 0

0 s ;

9 4℃.

4 0 s ;

5 4 ℃ ,

5 0 s ;