PDF《o E6细 胞诱导细胞 凋亡》

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8 0

5 .

1 .

2 细胞培养与病毒感染 V e r o E 6细胞用含

1 0 %胎牛血清( F C S ) 的ME M 培养液培养 ,病毒 感染 的细胞用 含2.5%F C S 的ME M 培养液培养.感染细胞方法详见文献L

5 J .

1 .

3 间接荧光染色和 Ho e c h s t

3 3

2 5 8染色【 o , 收稿 日期 :2

0 0

3 .

0 9 .

1 1 ,修回日期 :2

0 0

3 .

0 9 .

1 9 基金项 目:湖北省 S AR S科技攻关计划特别基金资助(

2 0 o

3 AA

3 o

5 B O

3 ) ;

武汉大学 S AR S科技攻关特别基金资助 作者 简介 :鄢然(

1 9

8 2 一),女,湖 北省 籍,大学本 科生. 通 讯作 者 :鄢 慧民(

1 9

6 4 - ) ,男 .江西 省籍 ,副教授 ,从 事粘膜 免 疫抗 病 毒机 制研 究. Co r r e s p o n d i n g a u 山o L T e l :

0 2

7 ・

8 7

8 6

9 8

9 7: F a x :

0 2

7 ・

8 7

8 6

9 8

9 7 ;

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5 4

2 中国病毒学第l8卷 培养在

9 6孔板中的 V e r o E 6细胞 , 如前所述方 法, 以50T C I D5 0的SARS ― C o V感染 V e r o E 6细胞,

4 8 h后可观察到典型 CP E出现 ,用2%多聚 甲醛固 定细胞

1 0 mi n , 用PBS ( p H7 .

4 ) 润洗 , 再用

0 .

1 %T r i t o n X一100( 用pH7.4的 P BS稀释 )通透

3 mi n ,然后用 含l%牛血清 白蛋 白的 P B S润洗.同时用两种不同 的荧光染色方法对感染细胞进行染色观察.首先 , 用SAR S恢复病人的血清 ( 稀释至 1:

1 0

0 )于37℃温育结合

4 5 mi n ,洗涤 3次,然后再加 F I T C荧 光标记的羊抗人 I g G ( 美国 S o u t h e r n B i o t e c h n o g y C o . )进行荧光染色,以检测 S AR S ― Co V 对细胞的 感染 .然后 ,用Ho e c h s t

3 3

2 5 8对细胞核染色 .在Ni k o n E c l i p s e T E

3 0 0显微镜下 以适 当滤镜观察病毒 感染和细胞核染色结果并用数码相机摄影记录 .

1 .

4 D N A片段的纯化提取与电泳检测I

6 J 以5

0 T C I Ds o的SARS ― C o V感染培养在 T

2 5培 养瓶中的 V e r o E 6细胞 ,感染

2 4 h和48h后收集细 胞 ,用无 Mg 、C a

2 + 的PBS冲洗两次 ,再加

0 .

5 mL 含10mmo l / L I r i s ― H C1( p H7 .

8 ) ,1 mmo l / LE DT A,

1 0 m m o l / L N a C

1 ,l % s S s和lmg/mL蛋 白激酶 K 的溶液

6 0 ℃温育

2 h ,裂解细胞 .D NA提取和琼脂 糖凝胶 电泳检测详见文 .

1 .

5 P I染色和 D NA含量 的流式细胞仪分析【

6 '

, J 以50TCID5

0 的SARS ― C o V 感染培养在 T

2 5 培养瓶中的 V e r o E 6细胞 ,感染

4 8 h后胰蛋 白酶消 化并收集细胞 . 所收集 的细胞用 P B S洗涤后用

7 5 % 乙醇一

2 0 . C 固定过夜 , P B S洗涤两次,

5 01 .

1 g / mLP I ( S i g ma ― Al d r i c h )和0.1%ofRNA酶A于25.C下

3 0 mi n .经PI染色 的细胞 用流式细胞 仪( B e c t o n D i c k i n s o n ) 分析 DNA含量.

2 结果与讨论

2 .

1 S A R S - C o V感染 V e r o E

6 细胞的生物化学特征 大量研究表明细胞凋亡具有明确的细胞学和生 物化学特征, 其 中之一就是染色体 DN A被切割成长 度为

1 8

0 ~

2 0

0 b p及其整数倍的片段 ,核质凝缩 ,形 成凋亡小体l 引.我们从病毒感染的V e r o E

6 细胞中提 取DNA进行

2 %琼脂糖凝胶 电泳发现,S A RS ― C o V 感染的细胞染色体 DN A 在整个 电泳泳道上分散有 大小不等的带,呈 Ladder 状.感染

2 4 h的细胞染 色体 D NA开始出现断裂的片段, 感染