PDF《两种方法冻存胎儿卵巢组织后的活力判断》

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203 号,6 -

8 周龄 ,体重

18 -

20 g ,由宁夏医学院 实验动物中心提供. 1.

2 方法 1. 2.

1 试剂配制 冷冻保护液分为 A 液和 B 液. A 液为 1.

5 mol/ L 乙二醇 + 含200 mL/ L 小牛血清 的PBS ;

B 液为 1.

5 mol/ L 乙二醇 + 0.

1 mol/ L 蔗糖 + 含200 mL/ L 小牛血清的 PBS.解冻液 (C 液) 为0.

5 mol/ L 蔗糖 +

200 mL/ L 小牛血清的 PBS 液. 1. 2.

2 冷冻容器 采用直径 0.

5 cm、 长8c m 的塑料 麦管作冷冻管 ,该管中装有 B 液和 C 液 ,两液间用约 40μL 的气泡隔开;

冷平衡在自制的液氮蒸气槽中进行. 1. 2.

3 快速冻存法 卵巢皮质片置于 A 液,4 ℃ 渗 透平衡

30 min 后 ,再置于 B 液,4 ℃继续渗透平衡

30 min ,移入含有 B 液的 0.

5 mL 麦管中.麦管在液 氮蒸汽浴槽( ≤-

120 ℃ ) 中冷平衡

5 min 后迅速投入 液氮保存. 1. 2.

4 慢速冻存法 卵巢皮质片置于 A 液,4 ℃ 渗 透平衡

5 min ,置于含有

1 mL B 液的冻存管(1.

8 mL Nunc) ,4 ℃ 继续渗透平衡

30 min 后 ,在程序冷冻仪 内慢速降温 : 以2℃/min 速率从

4 ℃降至 -

8 ℃, -

8 ℃ 手动植冰 ,0.

3 ℃ / min 降至 -

40 ℃、 -

30 ℃ / min 降至 -

150 ℃,投入液氮. 1. 2.

5 解冻方法 冻存

1 -

7 d 后 ,从液氮中取出麦 管和冻存管 ,置于

37 ℃ 的水浴中复温

1 min ,使卵巢 组织块连同 B 液、 C 液一起流入表面皿中 ,37 ℃ 温箱 放置

30 min ;

将组织块移入含

200 mL/ L 小牛血清的 PBS 液中 (4 mL) ,于37 ℃ 温箱中孵育

30 min ,充分 晃动 ,中间换液

1 次 ,以洗脱冷冻保护剂. 1. 2.

6 电镜观察 解冻后部分胎儿卵巢组织经常规 电镜标本制作方法制片.置H2600 透射电镜下观察 有无超微结构的损伤 ,并以卵母细胞膜结构的完整性 与胞浆内 ≤

10 %(面积比) 的空泡作为衡量冷冻后卵 母细胞形态正常的两个指标[9 ] ,计算正常形态卵母细 胞的百分比 ,判断冷冻保存效果. 1. 2.

7 卵巢移植 实验动物随机分为以下几组 :假 手术组(group

1 , n = 6) ;

去势对照组(group

2 , n = 6) ;

快速冷冻移植组 (group

3 , n = 12) 与慢速冷冻移植 组(group

4 , n = 14) .在手术过程中 ,group

1 暴露 卵巢后不接受进一步处理 ,缝合创口.Group

2 -

4 切除裸鼠自身双侧卵巢 ,group

2 不做进一步处理 , 缝合创口.在group

3 和4中,暴露裸鼠双侧肾脏 , 用显微手术镊轻提肾被膜 ,在其上极剪一小口将冻融 的胎儿卵巢皮质片迅速塞入肾被膜下并轻推至肾脏 下方 ,双侧移植完毕依次缝合切口. 1. 2.

8 光镜观察 分别于移植后

2 周和

8 周取材 , Bouin 固定 ,石蜡包埋 ,5μm 连续切片 , HE 染色.在Olympus 显微镜下观察卵泡的形态学改变 ,并随机 选取

10 个高倍视野(400 *,0.

188 5 mm2 / 视野) 计数 单位面积中的卵泡数. 1. 2.

9 雌激素的测定 分别于移植后

2 周和

8 周处

5 2

3 西安交通大学学报(医学版)第29 卷 死动物 ,经心脏穿刺取血 ,2

500 r/ min 离心

15 min ,取 上清液(即血清) ,采用双抗体放射免疫法测定雌激素 含量.放射免疫试剂盒来自北京北方生物技术研究 所 ,仪器为西安二六二厂生产的γ放射免疫计数器. 1.

3 统计学处理 应用 SPSS12.

0 统计软件对各组 实验数据进行分析.移植物存活率的比较采用χ

2 检验;

4 组之间血清 E2 水平的比较采用方差分析 , P <