PDF《中华人民共和国国家标准》

中华人民共和国国家标准 谷物和大豆中赭曲霉毒素 A GB/T 13111-91 的测定方法 Method for determination of ochratoxin A in cereal and bean

1 主题内容与适用范围 本标准规定了谷物和大豆中赭曲霉毒素 A 的薄层色谱测定方法.

本标准适用于小麦、玉米和大豆中赭曲霉毒素 A 的测定. 在薄层板上赭曲霉毒素 A 的最低检出量为 4ng.本方法的最低检测量为

10 μg/kg.

2 原理 用三氯甲烷-0.1mol/L 磷酸或石油醚-甲醇/水提取样品中的赭曲霉毒素 A,样品提取 液经液-液分配后,根据其在

365 nm 紫外光灯下产生黄绿色荧光,在薄层色谱板上与标准 比较测定含量.

3 试剂 以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂,水为蒸馏水或同等纯度的水. 3.1 石油醚(60~90℃或30~60℃). 3.2 甲醇. 3.3 三氯甲烷. 3.4 甲苯. 3.5 乙酸乙酯. 3.8 甲酸. 3.7 冰乙酸. 3.8 乙醚. 3.9 苯-乙腈(98:2). 3.10 0.1mol/L 磷酸[c(H3PO4)=0.1mol/L]:称取 11.5g 磷酸(85%)加水稀释至 1000mL. 3.11 2mol/L 盐酸溶液[c(HCL)=2mol/L]:量取

20 mL 盐酸,加水稀释至

120 mL. 3.12 4%氯化钠溶液. 3.13 0.1mol/L 碳酸氢钠溶液[c(NaHCO3)=0.1mol/L]:称取 8.4g 碳酸氢钠,加适量水溶解, 并用水稀释至

1000 mL. 3.14 硅胶 G:薄层层析用. 3.15 赭曲霉毒素 A(以下简称 OA)标准溶液:用苯-冰乙酸(99:1)配成

40 μg/mL 赭曲霉毒 素A贮备液,并用紫外分光光度计测定其浓度.浓度的测定参照 GB 5009.22《食品中黄曲 霉毒素 B1 的测定方法》中2.14 条(赭曲霉毒素 A 的最大吸收峰波长

333 nm,分子量 403, 克 分子消光系数值为 5550).精密吸取贮备液,用苯稀释成每毫升含赭曲霉毒素 A0.5μg,赭 曲霉毒素 A 标准液应置冰箱中避光保存. www.grainnet.cn

4 仪器 所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡,用自来水,蒸馏水冲洗. 4.1 小型粉碎机. 4.2 电动振荡器. 4.3 玻璃板:5cm*20cm. 4.4 薄层涂布器. 4.5 展开槽:内长 25cm、宽6cm、高4cm. 4.6 紫外光灯:365 nm. 4.7 微量注射器:10μL、50μL . 4.8 具0.2mL 尾管的

10 mL,小浓缩瓶.

5 分析步骤 5.1 提取 5.1.1 甲法 称取 20g 粉碎并通过

20 目筛的样品,置于 200mL 具塞锥形瓶中,加入 100mL 三氯 甲烷 和10mL 0.1mol/L 磷酸,振荡 30min 后通过快速定性滤纸过滤;

取20ml,滤液置于 250mL 分 液漏斗中,加50mL 0.1mol/L 碳酸氢钠溶液振摇 2min,静置分层后,将三氯甲烷层放入另一 个100mL 分液漏斗中(少量乳化层,或即使三氯甲烷层全部乳化都可放入分液漏斗中),加入50mL 0.1mol/L 碳酸氢钠溶液重复提取三氯甲烷层,静置分层后弃去三氯甲烷层(如三氯 甲烷层仍乳化,弃去,不影响结果). 碳酸氢钠水层并入第一个分液漏斗中,加约 5.5mL 2mol/L 盐酸溶液调节 pH2~3(用pH 试纸测试), 加入 25mL 三氯甲烷振摇 2min,静置分 层后,放三氯甲烷层于另一盛有 100mL 水的 250mL 分液漏斗中,酸水层再用 10mL 三氯甲烷振 摇、 提取、静置,将三氯甲烷层并入同一分液漏斗中.振摇、静置分层,用脱脂棉擦干分液漏 斗下端,放三氯甲烷层于一 75ml 蒸发皿中,将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干.用约 8mL 三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解,转入具尾管的 10mL 浓缩瓶中,置80℃水浴锅上用蒸汽加 热吹氮气(N2),浓缩至干,加入 0.2mL 苯-乙腈(98:2)溶解残渣,摇匀,供薄层色谱点样用. 5.1.2 乙法 称取 20g 粉碎并通过

20 目筛的样品加于 200mL 具塞锥形瓶中,加30mL 石油醚和 100mL 甲醇-水(55:45),在瓶塞上抹上一层水盖严防漏.振荡 30min 后,通过快速定性滤纸滤入分 液漏斗中,待下层甲醇水层分清后,取出 20mL 滤液置于 100mL 分液漏斗中,用pH 试纸测 试, 一般为 pH5~6.加入 25mL 三氯甲烷振摇 2min,静置分层后放出三氯甲烷层于另一分液 漏斗 中,再用 10mL 三氯甲烷重复振摇提取甲醇-水层(在用三氯甲烷振摇提取时,如发生乳化现 象,可滴加甲醇促使其分层),将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中,加入 50~100mL 4% 氯化钠溶液(加入量视品种不同而异,大豆加 100mL,小麦、玉米则加 50mL 左右),振摇放 www.grainnet.cn 置(如为大豆样品提取液还须轻轻反复倒转分液漏斗,使乳化层逐渐上升.如乳化严重可 加入少许甲醇),待三氯甲烷层澄清后,用脱脂棉擦干分液漏斗下端,放三氯甲烷层于 75mL 蒸 发皿中(如为大豆样品须再加入 10mL 三氯甲烷振摇,三氯甲烷层合并于同一蒸发皿中),将 蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干. 以下操作自 用约 8mL 三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解 起,按甲法操作. 5.2 测定 5.2.1 薄层板的制备 称取 4g 硅胶 G,加约 10mL 水于乳钵中研磨至糊状.立即倒入涂布器内制成 5cm* 20cm, 厚度 0.3mm 的薄层板三块,在空气中干燥后,在105~110℃活化 1h,取出放干燥器中保存. 5.2.2 点样 取两块薄层板,在距薄层板下端 2.5cm 的基线上用微量注射器滴加两个点:在距板左 边缘 1.7cm 处滴加 OA 标准溶液 8μL(浓度 0.5μg/mL),在距板左边缘 2.5cm 处滴加样液