PDF《E7基 因的分 离、克隆 和序 列分 析。》

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2 .

一第1 I 卷第3 期1996年 9月中国病毒学VIR0L0G[ C A S I NI CA .

1 1 No.

3 s e p

1 9

9 6 湖 北地 区宫颈癌 组织 中人乳 头 瘤病 毒16型 E

7 基因的分离 、 克隆和序列分析 . 伍欣 星赵文先 l / 丁晓华 苏应斌 一r.――I_-__一r(胡北医辩 大学病 毒研 究所, 武祝

4 3 ~}

7 1 ) 是DNA 病毒,其基因组全长

7 .

9 k b , 分为早期区( E) 、 晚期 区( L ) 和 上赫调控 区( URR) .E区吉有 5个 开放读框 ( O R F ) , 其中E

7、B6基因能 使原 代细胞转化和使体 外培养 的细 胞永生化 ;

E 7还能编 码具有转化和反式墩 活作用的 E

7 蛋白. 因而成为肿瘤学研 究的热点 _

2 1

9 9

1 年Chert等报 道 利用 HP V1

6 E 7转染小 鼠纤维母细胞和黑色素瘤细胞, 并用来免疫同基因 小鼠. 发现小 鼠机体 产生了特异性 抗体. 将 移植 的黑色 素瘤在两 周 内排斥D】 . 由于宫 颈癌 DNA 中60%以上 都含 有HP V1

6 E7 , E 6同源序列 】 , 人们希望 能利用这些 分 子及 其编 码 的蛋 白抗 原来治疗 和预防宫颈癌以及与 H P V癔 染密切相 关的其它肿瘤 . 本文通过对湖北地 区宫颈癌组织 中分离的 HP V1

6 E 7基 因的克隆 、 测序 , 探讨 地方株与 标 准株( 德 国株 ) E 7棱 苷酸 顺序的差异, 以了解 HP V1 6在 本省的分布 , 为基 因表达 和疫苗矸镧打 下 基础 . ・ 材料 和 方法

1 材料

1 .

1 宫 颈癌 话检 组织 取 自湖北 医科大学 附属 二 医院肿 瘤科 .患 者湖 北暑 .病理 学 检查 诊断为宫颈 鳞状 组胞 癌奉立于

1 9

9 5年 9月

1 5日收 丑,

1 9

9 6年 1月

2 3 日謦 目・奉鼍磨壁期北省拜垂. ^五 拜技攻关唾 目经费资助 t , 中目拜学 院上 毒生糟 化学 研究 所, 上毒

2 O

0 0

3 2 维普资讯 http://www.cqvip.com 第3期伍欣 星等:湖北地 区官 颈癌组 织 中人乳 头 瘤病毒

1 6型E7基 因的 分离、克隆 和 序列 分析

2 2

1 l

2 HP V1

6 E 7引物根 据 已发 表的 标准 株E7桩 苷酸 序列设计… . 由中国科 学院上海 细胞生物学 研 究所 合成. 两引 物5端分 别漏加有 E c o RI 和l~adi酶切 位点.具悻榜 苷 酸组 成如 下:5一GGGAA'

I

1 CATGCATG G AGATA CACCTAC 一3 Ec o R I

5 . _ _ G I l A 卫1AHi I

1 dⅢ

1 .

3 T a qD NA聚合 酶 购于 华 中农 业 大学 国家 重 点实验 室;

棱酸限制 性 内切酶 E ∞RI、 Hi I I d Ⅲ和T4DNA连 接酶 以及 质粒 p uc k s DN A、 x

一、IPTG等购 自华 美生 物工 程公 司.

1 .

4 受体 菌为EiJM109,奉室 保存 .

2 方法

2 .

1 DNA 聚合 酶链 反应(PCR) 鼠宫 颈瘟 活检 组织 中提取 DNA. 以其 为模 扳. 用上 述二 引钧 进行 H P V1

6 E

7 基 因扩 增.P C R实验 总体 积为100其中舍 模扳 DNA

0 .

5 . d N TP ( 2mmc i / L)

1 0止 引物 各25p mo l / L ,

1 0 *缓 冲液

1 0 L . 在95℃ 7ml n . 接着为两个

1 5 次 反应 循环 .第 一类循 环是93℃

1 ml n .

4 5℃ 1mi l l ,

7 2℃

1 v a i n ;

第二类循 环是

9 3℃ 1r ai n ,5 5℃

1 ml n ,7 2℃

1 mi n

3 0 最后

7 2℃ 延伸 7mi n .

2 .

2 P CR产 物分 子 克隆 酚. 氯仿 抽提 P C R产物 .用Hi n d l l

2 0t I , 旭消化PCR产物 5h . 接着用EcoRl

2 0t I , 消化 过夜 .p UC

1 8质粒DN A用EcoRI 和Hi n d m各5t I , 旭同时酶 切 过夜 .酶切产物再次用 酚一氯仿 抽提纯化.按外 源基 因和 载悼 分子