PDF《E7基 因的分 离、克隆 和序 列分 析。》

3 :

1 ( 摩 尔浓度 )在T4DNA连接 酶催化下,

1 6℃ 连接 过夜取约

0 . 1阿 连接 DNA棍 台涟 加入 J M1

0 9感受 态 纲胞 .感受 态细 皇崩备 爰 转化 过程 按文 最进行.转l 北 营在 古x-a~l、IPTG、 Amp的uj 平皿中于

3 7℃培养l6l

1 . 筛选 白色 营蔫 .

2 .

3 DNA序列 分析 采用 , S a n e e T双脱 氧链终 止莹 对阿w I

6 E T - I - l ~ DN^进行瑕向一序 . 结果l官颈 癌组织 DNA 中HP V1 6E 7基 因扩簟 经PCR30次循环 后, 将扩增 产物在

1 .

5 %璩艚糖凝胶上 电泳分析, 在Ⅱ. 3曲娃显现清 晰 的阳性 扩增带 .与HP VI 6标准 株质粒 DNA扩增 带处同一 水平 ;

以pBR3

2 2DNA 为模 扳(阴性对照 ) 未出现扩增带( 图1).2阳性 克隆 的鉴定 挑取转化的 白色菌 落, 藏体培养 后.甩碱裂解法 提取质粒 D NA'

经0.8%琼脂 糖凝 胶电泳, 初筛 出 4个 比对照 ( p UC

1 8 ) DNA分子 量大 的克 隆.经EcoRI 和Hi n d Ⅲ双酶 消化,

1 .

5 %璩 脂糖凝 胶电泳鉴定, 其中1个 含有 约0.3kb的 Eo

0 RI 肛{ 砌 Ⅲ插 入片段. 此质粒命名为pHP V1

6 E

7 - HB( 图2).3HP V1

6 E '

7 -

1 t B桉苷酸序捌分析 在pHP V1

6 E

7 - HB克璧 基础上 . 通 过核 酸序列分析获得 了HP V1

6 E

7 . F I B全部 核苷 酸顺 序.H P V1

6 E

7 一FIB基 因垒长

2 9

4 b p . 其大 小与 标准 株完 全一 致.将两者核 苷 酸顺 序进 行比较, 发现有两处碱 基发生 了c- ÷ T 突变 ;

第43位 密码子 C A A 变为TAA, 第76位 C GT变为TGT.前一个突变将谷氨酰密码子变为终止密码( Oc h r e t e r mi n a t i o n∞d o Ⅱ ) , 即无义 突变 ( n

0 I l 一黜mu t a t i o n ) , 见图

4、5.维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒学第l1卷 田1宫颈癌 组织 DNAP CR产物 电 沫分析 t r i g1 E l ∞m a 口蜘ofPCRp r o d u c t s o f CC TDNA M .p B R

3 2 2DN^/ Hi n f l

1 .p HPV I 6DNA ( + ) c o n t r o l 2.p B R

3 2 2DN A ( 一) e o n u o l 3―5 . D NA 鼬m e o f c d aI n m at mu e ( C CT) 田2重组 质粒 的酵切 鐾定 F

2 I 6m t i f ic e t i o n oft h e r e e mn b / m m l I i l b yE c t t ~ e n dHi n d Ⅲ M . ~ , DNA/ t - F r edⅢ ( mmk e r )

3 . p UC1

8 DNA/ E a ~ ~l - ~ a l

1 a n d

2 . N o

4 哪b.m皿taHd,Hi n d Ⅲ

4 a n d

5 . No .

4 r e e o mb l a a m 出,Ec oR[ + Hi n dU l 6.P CR p r o d l p HPV1

6 E7 DNA (+) c o n t r ~ ~

7 . p a r

3 2

2 DNA / Hh a t l( me r k e r ) 讨论HP VI 6是宫颈 癌及癌前病变 的重要病原 .研究HP VI

6 E 7基 因及其 编码 的E7蛋 白在 宫 颈癌发生和发展 中的作 用, 是当前引人注 目的领域 .我们 采用加端 P C R技术 , 从湖 北地 区一 宫颈癌组织 DNA 中分离 出HP V1

6 E 7基因, 并将其进行分子克 隆.此技 术极其 省时方便和 经济.一近年来 , 对卸P v 的分子 生物学研 究进一 步 阐明 了其 致病 机理 .E 7基 因所 编码 的E7蛋 白两端有两个保 守功能 区.其一 为氨基末端 ( N端)的37个氨基酸 . 此 区域与肿瘤病毒一腺病 毒E1 A和SV4 0T抗原 的保守 区同源, 能与抗 癌基 因RB的表达 产物 结合, 导致 细胞 恶性 增生;

其二 为羧基末端 ( c端)的6O个 氨基酸 , 含有 两个 C y s - X- X- Cy s框, 即所 谓锌指结构 ( Z i n c f i n g e r s t r u c t u r e ) .据报道 , 完整的 c端对 E 7蛋 白的生物学功能有稳 定和 增强 作用 .锌指结构 突变, 可消除角化细胞系永生态, 部分或完全抑 制细胞 转化 _