PDF《中的应用》

-

1 - 实时荧光定量 PCR 技术及其在环境氨氧化细菌研究 中的应用 赵大勇

1 ,燕文明

1 ,冯景伟

2 ,袁守军

2 ,曾巾

3 1 水文水资源与水利工程科学国家重点实验室,河海大学水文水资源学院,南京(210098)

2 合肥工业大学土木与水利工程学院,合肥(230009)

3 污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京大学环境学院,南京(210093) Email:dyzhao@hhu.

edu.cn 摘要:实时荧光定量 PCR 技术是近年来新出现的一种核酸定量技术.本文综述了该项技术 的原理、 特点及其在环境氨氧化细菌研究中的应用, 同时也指出了该技术存在的问题及其发 展应用前景. 关键词:实时荧光定量 PCR,氨氧化细菌,分子生物学 中图分类号:X83 1.引言 实时荧光定量 PCR 技术(Real time fluorescent quantitative PCR, Real-time QPCR)是在 常规 PCR 基础上发展起来的核酸定量技术. 该技术是指在常规 PCR 反应体系中加入荧光染 料或荧光探针,通过检测荧光信号的强度来实时监测整个 PCR 过程,最后应用建立的标准 曲线计算出样品中特定 DNA/RNA 的起始浓度, 从而达到对目标核酸定量的目的. 与传统的 PCR 技术相比,RT-QPCR 技术自动化程度更高,且克服了传统 PCR 存在的不能准确定量、 易污染、假阳性率高等缺点. 实时荧光定量 PCR 技术的原理最早由 Higuchi 等[1] 在Nature 上发表论文提出:使用 SYBR Green I 取代溴化乙啶 (EB) 与核酸结合, 并用改装的 PCR 仪来检测样品的荧光强度, 第一台商业化设备在

1997 年开始投入使用[2] .从此以后,RT-QPCR 在医学领域广泛地应用 于病毒以及致病基因的定量检测[3-4] ,该技术在环境领域的应用开始于

2000 年之后,主要用 于环境中特定微生物类群的定量分析[5-7] ,以及环境因子改变对于特定微生物类群数量影响 的研究[8] . 本文综述了 RT-QPCR 技术的原理、特点、存在的问题,以及该技术在环境氨氧化细菌 (Ammonia oxidizing bacteria,AOB)研究中的应用. 2.实时荧光定量 PCR 技术的原理、标记方法和特点 2.1 原理 实时荧光定量 PCR 是向常规 PCR 反应体系中添加能产生特定波长荧光的染料或探针, 这些荧光染料和探针只有与目标核酸结合后才会发出荧光, 通过特定仪器来检测荧光信号的 强弱,可以间接反映体系中目标核酸的数量,从而实现对整个 PCR 反应过程进行监控,检 测到的荧光信号的变化可以绘制成如图

1 的一条曲线. 通过对收集到的荧光信号进一步处理 可以用于核酸样品的定量研究. 在PCR 反应初期,由于目标核酸数量较少,所产生的荧光信号比较弱,背景值干扰较 大,用于定量误差较大.RT-QPCR 的可行定量是在 PCR 扩增的指数期进行的.定量时,首 先引入循环域值数(Cycle threshold, Ct)这个概念.它的含义是指在 PCR 循环过程中,荧光 信号的增加由背景值进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数(图1) ,一般以 PCR 反应 的前

15 个循环的荧光信号作为背景值,以3~15 个PCR 循环的荧光信号的标准偏差的

10 倍作为 PCR 反应进入指数期的荧光域值.在PCR 反应的指数期,Ct 值与样品中核酸模版的 http://www.paper.edu.cn 中国科技论文在线 -

2 - 起始拷贝数的对数存在线性关系(图2) . 图1RT-QPCR 荧光强度变化曲线 Fig.

1 Relative fluorescence intensity curve of RT-QPCR 图2RT-QPCR 中用于定量的标准曲线 Fig.