PDF《中的应用》

Q:荧光淬灭基团) Fig.

3 Schematic diagram of molecular beacon (R: reporter;

Q: quencher) 2.3 荧光定量 PCR 技术的特点 与传统的 PCR 技术相比, 荧光定量 PCR 技术有了许多改进之处, 总结起来有以下几点: (1) 荧光定量 PCR 技术与传统的 PCR 技术相比实现了核酸的定量研究,极大的扩 展了其在各个领域的应用. (2) 荧光定量 PCR 技术对于目标核酸的检测非常灵敏. Kolb 等[21] 采用 RT-QPCR 技 术检测了环境中甲烷氧化菌的数量,检测限可以达到

10 cells/样品. (3) 荧光定量 PCR 技术的标准曲线对靶 DNA 的定量一般都会涵盖

7 个数量级以上, 因此,该技术可以检测相当范围内的目标核酸数量,非常方便. (4) 荧光定量 PCR 技术是在 PCR 反应的过程中完成对样品的定量检测,不需要后 http://www.paper.edu.cn 中国科技论文在线 -

4 - 续处理,减少了工作量并且消除了使用溴化乙啶等致突变物的危险. 3.实时荧光定量 PCR 技术在氨氧化细菌检测中的应用 目前, 实时荧光定量PCR技术已经广泛的应用于微生物群落的组成和数量变化检测以及 环境因子对特定微生物类群数量的影响研究[21-23] . 硝化作用是生态系统中氮素循环的重要过 程之一也是污水处理脱氮过程中的关键步骤.硝化作用主要由两大类群的微生物分两步完 成:第一步是将氨氧化为亚硝酸,由氨氧化细菌(AOB)完成;

第二步是将亚硝酸氧化为 硝酸,由亚硝酸氧化细菌(Nitrite oxidizing bacteria, NOB)完成[24] .由于氨氧化过程是硝化 过程的限速步骤, 因而氨氧化细菌比亚硝酸氧化细菌受到更多的关注, 成为研究硝化作用的 焦点[25] .由于氨氧化菌生长慢、代时长,很多类群无法培养,采用传统的细菌分离培养方 法难以对其存在和功能进行鉴别和研究[26] .RT-QPCR技术是以核酸为基础的研究技术,不 需要对所研究的微生物进行分离培养,因此适用于环境中氨氧化细菌的研究. 目前,RT-QPCR 技术对氨氧化细菌的研究主要包括环境样品研究和废水生物处理反应 器研究两大方面,具体的研究报道见表 1. 表1RT-QPCR 技术对氨氧化细菌的研究报道 Tab.1 Studies of ammonia oxidizing bacteria using RT-QPCR 样品来源 引物名称 标记方法 参考文献 耕地土壤 CTO 189fA/B/C;

RT1r Taqman 荧光探针(TMP1) [5] 土壤 A189;

amoA-2R′ Taqman 荧光探针(A337) [8] 森林土壤 CTO 189fA/B/C;

RT1r Taqman 荧光探针(TMP1) [27] 城市污水处理 厂曝气池污泥 CTO 189fA/B/C;

RT1r Taqman 荧光探针(TMP1) [28] 污水处理厂活 性污泥 CTO 189fA/B/C;

RT1r Taqman 荧光探针(TMP1) [29] SBR 生物反应 器中颗粒污泥 或活性污泥 CTO 189fA/B/C;

RT1r Taqman 荧光探针(TMP1) [30] 脱氮生物反应 器污泥 (NSMeur-828F;

NSMeur-1028R);

(NSMmob-988F;

NSMmob-1282R);

(NSMnit-438F;

NSMnit-633R);

(NSMcry-211F;

NSMcry-434R);

(NSS-209F;

NSS-478R) Taqman 荧光探针 (NSMeur-984T;

NSMmob-1243T;

NSMnit-483T;

NSMcry-270T;

NSS-432T) [31] 3.

1 环境样品检测 从表1中可以看出:实时荧光定量PCR技术对环境中氨氧化细菌的研究目前主要用于土 壤方面.Hermansson等[5] 用RT-QPCR的方法检测了瑞典Mellby地区施用氮肥和不施氮肥耕地 中氨氧化细菌的数量.结果表明:在施用氮肥的耕地中氨氧化菌的总数约为6.2*107 cells/g 土壤,比不施用氮肥的土壤高出三倍.Okano等[8] 用针对氨氧化过程中的功能基因amoA设计 的引物和荧光探针研究了土壤中氨氧化细菌的数量,该方法的检测限可以达到1.3*105 cells/g土壤.同时,作者还研究了向土壤微宇宙中添加高浓度的(NH4)2SO4(1.