PDF《中的应用》

2 The standard curve for RT-QPCR measurement 样品中核酸模版的起始拷贝数(N0)与循环域值数(Ct)成反比,利用一系列已知起始 拷贝数的标准品可绘制出标准曲线,确定公式(1)中的常量 a 和b.对未知样品定量时,可先 通过实验求出 Ct 值,然后根据 Ct 值可利用标准曲线计算得出该样品中核酸模版的起始拷贝 数N0 [9-10] .

0 log t N a b C = ? * (1) 标准曲线的构建需要一系列已知目标核酸拷贝数的细胞、 纯培养物的基因组或包含目的 核酸片段的质粒. 细胞浓度的定量可通过平板计数或显微镜计数得到, 基因组或质粒的定量 可通过测定其

260 nm 处的吸光度或相关的试剂盒来完成[11] . 2.2 荧光标记方法 目前,荧光定量 PCR 技术所采用的标记方法主要包括荧光染料和荧光探针两类. 2.2.1 荧光染料标记 利用荧光染料能够与双链DNA结合,发出强荧光信号,而游离的染料分子不发出荧光 信号的特性,可以向PCR反应系统中添加过量的嵌入染料(常用SYBRTM Green I) ,利用荧光 信号增加与PCR产物增加同步的原理,通过检测荧光信号的强弱对PCR产物进行定量[12] ,然 后再应用事先构建的标准曲线对目标核酸的初始含量进行计算. 荧光染料标记最大的优点在 于它能够用于任何核酸模版,不需要另外设计荧光探针,操作简便、易行,成本低等.但这 种方法也存在明显的不足[13] : 由于荧光染料的非特异性, PCR扩增体系中的非目的片段 (如: 核酸模版、引物二聚体和非特异性PCR扩增产物)都会与荧光染料结合,影响定量结果.这 种干扰可通过优化反应条件降低引物二聚体的形成以及分析PCR产物的溶解曲线等手段来 解决.另外,由于SYBR Green I对PCR有一定的抑制作用,并且荧光强度较低,稳定性差, http://www.paper.edu.cn 中国科技论文在线 -

3 - 近来也出现了一些新型的荧光染料,如:噻唑橙(TO) 、SYBR Green ER和Eva Green TM等[14-15] . 2.2.2 荧光探针标记 (1)Taqman 探针 Taqman探针是目前在荧光定量PCR反应中应用最广泛的标记技术.该探针是一段寡核 苷酸序列, 在其5′端用荧光发射基团FAM (6-羧基荧光素) 标记, 3′端用荧光淬灭基团TAMRA (6-羧基四甲基若丹明)标记.当探针完整时,由于荧光共振能量传递作用(Fluorescence resonance energy transfer, FRET) , 5′端荧光发射基团发出的荧光被3′端荧光淬灭基团所抑制, 检测系统检测不到荧光信号.在PCR退火期,探针与DNA模版发生特异性杂交,在PCR延伸 期,Taq 酶发挥5′→3′外切酶活性将探针水解,5′端的发射基团脱落,不再与淬灭基团产生 FRET作用,释放的荧光信号可被检测器捕获.随着PCR过程的进行,荧光信号随扩增产物 成比例增加[16-17] .Minor grove binding(MGB)和Black hole quencher(BHQ)是两种新兴的 荧光淬灭基团,与TAMRA相比具有更低的荧光背景值,更高的灵敏度和杂交稳定性以及更 长的保存周期等优势[18] . 与荧光染料标记相比,Taqman荧光探针标记成本更高、设计更复杂,并且通常只能用 于长度小于150 bp的PCR产物的定量检测[11] . (2)分子信标 分子信标(Molecular beacon)是一种特殊的DNA探针.它是一段茎环发夹结构的单链 DNA分子,环部与靶DNA序列互补,为15~35 bp,茎部核苷酸互补,与靶DNA无序列同源 性,约8 bp,探针的5′端和3′端分别标记荧光发射基团和荧光淬灭基团[19] (图3).在PCR扩 增的退火阶段,分子信标的环部DNA与靶DNA杂交,茎部的发夹结构打开,荧光发射基团 与淬灭基团的FRET作用消失,产生的荧光强度与靶DNA的数量成正比.在PCR扩增的延伸 阶段,分子信标从模版上脱离,恢复茎环发夹结构.分子信标标记方法具有极高的特异性和 灵敏度, 能区分仅单个核苷酸差异的DNA, 因此可以用于单核苷酸多态性 (Single Nucleotide polymorphisms, SNPs)的检测[20] .目前,分子信标探针的设计难度很大,需要借助于相关的 设计软件(BeaconDesigner) . 图3 分子信标结构示意图(R:荧光发射基团;