PDF《健康和患病卵形鲳鲹肠道菌群结构的差异》

广西北部 湾海洋生物多样性养护重点实验室自主项目(2019ZB07) 通信作者:王志成,E-mail:[email protected] http://www.scxuebao.cn 菌群的生长受到抑制,宿主就会因肠道菌群紊 乱而发生疾病.对于水生动物而言,鱼类肠道 菌群结构还与养殖水环境、饵料等关系密切.因此,对养殖鱼类肠道菌群结构有比较全面的认 识,并对其与养殖水体和饵料相关性进行研究, 对防止细菌性疾病的暴发具有重要意义. 目前,对卵形鲳细菌病的研究多集中于 个别病例的病原分离鉴定[6-9] ,而对病害发生时 养殖鱼类肠道菌群结构的变化还未见报道.基于16S rDNA扩增子测序的高通量测序技术能全面 解析微生物群落中细菌种类和数量,在微生物 群落结构的研究方面得到广泛应用[10] .本研究拟 通过基于Illumina HiSeq测序平台的高通量测序手 段,对网箱养殖的健康和患病卵形鲳肠道菌 群的变化以及与养殖环境的相关性进行分析,为 卵形鲳的健康养殖以及病害防治提供理论基础.

1 材料与方法 1.1 样品采集及处理 样品于2017年9月10日采自广西北海铁山港 2个日常管理相同的卵形鲳养殖网箱,分别为 A和B网箱.A网箱中的卵形鲳未出现肉眼可 见的症状,作为健康用鱼取样;

B网箱卵形鲳 有脑干发红、鳃盖出血、肠道中有大量脓液等 肉眼可见病症,作为患病鱼取样;

同时取样样 品还包括养殖水体和饵料.健康鱼和患病鱼各 随机选取5条,体质量为165~318 g/尾,用无菌采 样袋收集适量颗粒饲料,同时在水深6 m处取水 样3 L,混合均匀后装入灭菌容器.将采集的卵 形鲳、水样以及饵料置于冰盒中运回实验室 处理. 健康鱼和患病鱼水样为同一海域不同网箱 中的水.健康鱼水样样品标记为W1,患病鱼水 样样品标记为W2,健康鱼肠道样品标记为H,患 病鱼肠道样品标记为D,饵料颗粒样品标记为F. 1.2 样品总DNA提取、PCR扩增及高通量测序 卵形鲳置于解剖盘中,用酒精对其体表 进行消毒,在无菌环境中解剖取其肠道,并用 无菌海水冲洗3次后置于灭菌的离心管,5条卵形 鲳的肠道混合成一个样本.称取0.5g颗粒饵料 于无菌离心管中,加入少量的无菌水.用组织 匀浆机分别对卵形鲳肠道样品和颗粒饵料匀 浆后,采用Soil DNA Kit试剂盒(Omega Bio-Tek, USA)提取细菌总DNA.将1 L水样先经5 μm孔径 的混合纤维膜预过滤,去除杂质后用0.22 μm无 菌聚醚砜膜(天津市津腾实验设备有限公司)进行 抽滤,将带有水体微生物宏基因组的滤膜剪碎, 用E. Z. N. A Water DNA Extraction Kit试剂盒 (Omega Bio-Tek,USA)提取.对16S rDNA基因可 变区(V3~V4区)进行PCR扩增,所用引物序列为 细菌特异性引物:341F (5′-CCTAYGGGRBG- CASCAG-3′)和806R (5′-GGACTACNNGGGT- ATCTAAT-3′).PCR产物使用浓度为2%的琼脂 糖凝胶电泳检测,送北京诺禾致源生物信息科 技有限公司进行基于Illumina HiSeq测序平台的高 通量测序. 1.3 数据分析 测序数据处理 根据Barcode序列和PCR 扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据, 截去Barcode和引物序列后,使用FLASH v 1.2.7 软件对每个样品的reads进行拼接、过滤得到高 质量的tags数据, 然后利用Qiime v 1.7.0软件与数 据库(Gold database)比对(UCHIME Algorithm)检验 并去除嵌合体序列,得到有效数据(effective tags). OTU聚类和物种注释 利用Uparse软件 v 7.0.1001对所有样品的全部effective tags进行聚 类,默认以97%的一致性identity将序列聚类成为 可操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs),同时选取OTUs的代表性序列,用Mothur 方法与SILVA的SSUrRNA数据库对其进行物种注 释分析,每个OTU在结果分析中视作一种细菌.使用MUSCLE v. 3.8.31软件进行快速多序列比对, 得到所有OTUs代表序列的系统发生关系.为了 去除样品序列差异引起的误差,对所有样品进 行均一化处理(以数据量最少的样品为标准,cut off=69 713),以处理后的数据为基础进行后续多 样性分析. 样品复杂度分析 利用Qiime软件v 1.9.1 计算Observed-species、Chaol、Shannon、Simpson、 ACE、Goods-coverage指数,使用R软件v 2.15.3 绘制稀释曲线并进行Alpha多样性指数组间差异 分析.