PDF《苹果茎痘病毒TaqMan 探针实时荧光定量》

王际轩 等, 2000) ,而快速、准确、灵敏、高效的病毒检测技术是实现苹果无毒化栽培的技术保障之一.目前检 测ASPV 的方法主要有酶联免疫吸附试验(李丽丽 等,2010b) 、分子杂交(杨俊玲 等,2006)和 常规 RT-PCR 技术(李丽丽 等,2010a;

陈红霞 等,2012;

乔雪华 等,2013) .但酶联免疫吸附试 验的灵敏度较低,而分子杂交检测步骤多且操作繁琐,常规 RT-PCR 技术虽然灵敏度较高,但需进 行PCR 后处理,易发生交叉污染,造成假阳性现象,且其只能对样品中的病毒进行定性检测,无法 做到定量检测.实时荧光定量 RT-PCR(Real-time RT-PCR)是将常规 RT-PCR 与荧光检测相结合的 核酸定量检测技术,具有灵敏度高、操作简便、特异性强、重复性好、污染少、用时短和可自动定 量分析等优点.目前,实时荧光定量 RT-PCR 技术在植物病毒检测方面的应用研究已有一些成果 (Ferriol et al.,2011;

高三基 等,2011;

郭立新 等,2012),但国际上尚无应用体外转录的 RNA 作为标准品构建标准曲线对样品中的 ASPV 进行绝对定量检测的报道.鉴于 ASPV 对苹果产业的严 重影响,急需建立一种更为灵敏准确的检测方法.本研究中根据 ASPV 外壳蛋白(coat protein,cp) 基因的保守序列设计了特异性引物和 TaqMan 探针,通过制备 cRNA 标准品构建标准曲线,建立了 ASPV 基于 TaqMan 探针的实时荧光定量 RT-PCR 检测方法.

1 材料与方法 1.1 材料 供试材料: 经常规 RT-PCR 检测确定携带 ASPV 的田间苹果叶片于

2012 年6月采自河北省清苑 县;

32 份田间供试样品于

2014 年6月分别采自河北省保定市、山东省临沂市和山西省运城市;

经 检测确认分别携带苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV) 、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV) 、苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)的苹果组培苗 及脱毒组培苗由河北农业大学生物技术实验室提供. 主要试剂:RNAiso Plus,RNAiso-mate,EASY Dilution,T7 体外转录试剂盒(TaKaRa,大连) ;

2*ES Taq MasterMix (ComWin Biotech, 北京) ;

TransStart Probe qPCR Super Mix, TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 及pEASY-T3 Cloning Kit(TransGen Biotech,北京) ;

DNA 凝胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒(Sangon Biotech,上海) . 仪器: Bio-Rad S1000 PCR 仪, Bio-Rad iQTM

5 实时荧光定量 PCR 仪均为美国 Bio-Rad 公司产品, NanoDrop

2000 微量紫外分光度计为美国 Thermo Scientific 公司产品. 1.2 引物及探针的设计与合成 利用软件 Clustal X(1.81)对GenBank 中登录的 ASPV cp 基因序列(NC

003462、AF

491930、 Qin Zi-yu,Sun Jian-she,Wang Na,Shao Jian-zhu. Development of a TaqMan real-time RT-PCR method for detecting Apple stem pitting virus(ASPV).

1402 Acta Horticulturae Sinica,2015,42 (7):1400C1408. JF

946775、 HM125155) 进行比对分析, 找到相对保守的区域, 利用 Primer Primer 5.0 和Primer Express v3.0 软件分别设计特异性引物和 TaqMan 探针(表1) ,探针 5′端标记荧光基团 FAM,3′端标记淬灭 基团 BHQ1, 由宝生物工程 (大连) 有限公司合成. ASPV cp 基因的扩增引物参考刘娜和牛建新 (2011) 报道的序列合成,标记为 ASPV-cp-F/R. 表1本研究中所用引物及探针序列 Table

1 Primers and probe sequences in this study 引物名称 Primer 引物探针序列(5′→ 3′)Sequence(5′ to 3′) 扩增产物长度/ bp Size of amplification products ASPV-cp-F CCCATTAGGTTAGGGTGTAGTTGCT