PDF《苹果茎痘病毒TaqMan 探针实时荧光定量》

108 ~ 1.31 *

101 copies ・ μL-1 ,8 个浓度梯度的 cRNA 为模板,分别 进行实时荧光定量 RT-PCR 和常规 RT-PCR 反应,比较两种方法的灵敏度. 以10 倍倍比稀释成 1.31 *

107 ~ 1.31 *

103 copies ・ μL-1 共5个浓度的 cRNA 为模板进行实时荧 光定量 RT-PCR 反应.同一次反应每个稀释度重复

3 孔,连续

3 d 进行

3 次重复验证试验,根据获 得的 Ct 值计算平均 Ct 值、标准差(SD)和变异系数(CV) . 利用建立的实时荧光定量 RT-PCR 方法对采自河北省保定市、山东省临沂市和山西省运城市的

32 份田间样品进行检测.

2 结果与分析 2.1 阳性质粒的构建 提取田间阳性材料的总 RNA 并反转录成 cDNA 后, 利用引物 ASPV-cp-F/R 进行 PCR 扩增,获得长度约为

1 444 bp 的特异条带,与预 期大小相符. 将其切胶回收、 纯化后进行克隆, 提取重组质粒并进行酶切鉴定,结果表明克隆 质粒中有与目的片段大小相符的片段插入(图1) . 其测序结果在 NCBI 经Blast 分析显示, 与ASPV cp 基因序列(HM125155)的相似度为 94%, 由此确定成功构建了 ASPV-cp 阳性质粒. 2.2 标准曲线的绘制 将ASPV-cp 阳性质粒进行线性化处理并 纯化后,利用 T7 体外转录试剂盒转录合成 cRNA 作为标准品.用EASY Dilution 将其按

10 倍倍比稀释成浓度依次为 1.31 *

10 8 ~ 1.31 *

101 copies ・ μL-1 的cRNA. 以此为模板进行实时 荧光定量 RT-PCR 反应并绘制标准曲线,结果 (图2)显示,标准品 cRNA 拷贝数浓度的对 数值与 Ct 值之间具有良好的线性关系, 决定系 数(R2 )为0.996,扩增效率(E)为99%,直 线方程为 y =C3.345 lg(x) + 43.679. Qin Zi-yu,Sun Jian-she,Wang Na,Shao Jian-zhu. Development of a TaqMan real-time RT-PCR method for detecting Apple stem pitting virus(ASPV).

1404 Acta Horticulturae Sinica,2015,42 (7):1400C1408. 2.3 实时荧光定量 RT-PCR 的特异性 以分别携带苹果茎痘病毒(ASPV) 、苹果茎沟病毒(ASGV) 、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV) 和苹果锈果类病毒(ASSVd)的苹果组培苗的总 RNA 为模板进行实时荧光定量 RT-PCR 检测.结 果如图

3 所示, 除ASPV 反应管中检测到了呈明显上升趋势的荧光信号外, 其余检测结果均为阴性, 表明该方法能够特异地检测 ASPV. 图3实时荧光定量 RT-PCR 特异性试验结果 Fig.

3 Specificity ........