PDF《苹果茎痘病毒TaqMan 探针实时荧光定量》

1 444 ASPV-cp-R ATGAAAGAAACACACACATAGCCGC ASPV-Probe3-F AGCAGACCGAGGGGTGTACTCT

260 ASPV-Probe3-R GCGGTACATCTGTATTTCCTTGCT ASPV-Probe3 FAM-TTGTGCCTTCTACGCGAAGCATGTC-BHQ1 1.3 总RNA 的提取及 RT-PCR 称取 0.1 g 苹果叶片,利用 RNAiso Plus 及RNAiso-mate 按照试剂盒说明书提取总 RNA,30 μL 无RNase 水溶解后, 取5μL 于1.2%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性, 并用 NanoDrop

2000 微量紫 外分光度计测定其浓度和纯度, 以A260/A280 = 1.9 ~ 2.1 的总 RNA 作为实时荧光定量 RT-PCR 的模板, 置于C80 ℃保存备用. 以阳性材料的总 RNA 为模板, 利用引物 ASPV-cp-F/R 进行 ASPV cp 基因的 RT-PCR 扩增.

20 μL 反转录体系中加入 2* TS Reation Mix

10 μL,TransScriptTM RT/RI Enzyme Mix

1 μL,gDNA Remover

1 μL,ASPV-cp-R(10 pmol ・ μL-1 )2 μL,总RNA

2 μL,无RNase 水4μL.反转录程序为:42 ℃孵育30 min,

85 ℃加热

5 min. 反转录结束后以

1 μL cDNA 为模板进行 PCR 扩增. PCR 反应体系

25 μL: 2* ES Taq MasterMix 12.5 μL,ASPV-cp-F/R(10 pmol ・ μL-1 )各1μL,cDNA 模板

1 μL,双蒸水 9.5 μL.PCR 程序:94 ℃

2 min;

94 ℃

30 s,55 ℃

30 s,72 ℃

30 s,40 个循环;

72 ℃

5 min. 1.4 阳性质粒的构建 PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳后,用DNA 凝胶回收试剂盒对符合目标片段大小(1

444 bp) 的特异条带进行切胶回收,纯化后与含有 T7 启动子的 pEASY-T3 载体连接,转化至大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5α 感受态细胞,挑取阳性克隆进行增菌培养,用质粒小量提试剂盒提取阳性 质粒.利用 NotⅠ内切酶对阳性质粒 pEASY-T3 载体上分别位于插入片段上游

23 bp 和下游

27 bp 处 的两个酶切位点进行双酶切处理,产物于 1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测.经酶切鉴定有目的片段插入 的质粒送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序. 经鉴定正确的阳性质粒命名为 ASPV-cp, 用于体外转录标准品 cRNA. 1.5 标准品 cRNA 的制备及标准曲线的绘制 阳性质粒经 PstⅠ内切酶进行线性化处理后,利用 T7 体外转录试剂盒(TaKaRa)进行体外转录 合成 cRNA,并用 RNase-Free DNaseⅠ对其进行纯化.用NanoDrop

2000 微量紫外分光度计测定其 纯度和质量浓度.拷贝数浓度(copies ・ μL-1 )= 质量浓度(ng ・ μL-1 )* 10-9 * 6.02 *

1023 /(RNA 碱 基数 * 330) ,将质量浓度换算为拷贝数浓度(陶珍珍 等,2015) .经计算制备的 cRNA 拷贝数浓度 为1.31 *

1010 copies ・ μL-1 . 用EASY Dilution 将标准品 cRNA 按10 倍比稀释成 1.31 *

108 ~ 1.31 *

101 copies ・ μL-1

8 个浓度, 以此为模板进行实时荧光定量 RT-PCR 反应.

20 μL 实时荧光定量 PCR 扩增体系包括 TransStart Probe 秦子禹,孙建设,王娜,邵建柱. 苹果茎痘病毒 TaqMan 探针实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立. 园艺学报,2015,42 (7):1400C1408.

1403 图1重组质粒酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图 Fig.

1 Agarose gel electrophoresis of the recombinant plasmid digested with restriction enzyme 图2实时荧光定量 RT-PCR 标准曲线 Fig.

2 Standard curves of TaqMan real-time RT-PCR qPCR Super Mix

10 μL,上、下游引物(10 pmol ・ μL-1 )各0.4 μL,TaqMan 探针(10 pmol ・ μL-1 ) 0.4 μL,模板 1.0 μL,双蒸水 7.8 μL.实时荧光定量 PCR 反应程序为:94 ℃预变性

30 s;

94 ℃变性

5 s,55 ℃退火

15 s,72 ℃延伸

15 s,共40 个循环.反应结束后,利用分析软件自动生成标准曲线. 1.6 实时荧光定量 RT-PCR 反应体系的验证与田间样品检测 以分别携带 ASGV、ASPV、ACLSV 和ASSVd 的苹果组培苗的总 RNA 为模板,进行实时荧光 定量 RT-PCR 扩增,检测该体系的特异性. 以10 倍倍比稀释成 1.31 *