PDF《mMYB》

1 材料与方法

1 .

1 植物材料与胁迫处理 选择四川眉山林场一代种子园耐低磷家系的种子,经表面消毒后在3

0 ℃无菌水中过夜浸泡催芽,种①收稿日期:2

0 1

6 0

3 0

6 基金项目:国家8

6 3子项目(

2 0

1 1 AA

1 0

0 2

0 3

0 1 ) ;

贵州省科技重大专项(

2 0

1 2

6 0

1 1

1 ) . 作者简介:刘沛宇(

1 9

9 1 ) ,男,贵州贵阳人,硕士研究生,主要从事林木生物技术与遗传育种的研究. 通信作者:文晓鹏,教授. 植于石英砂介质的胸径1 2c m 的营养钵中. 待幼苗出芽2 8d 后进行磷胁迫与对照处理,以全 H o a g l a n d营 养液作为对照,磷胁迫处理的营养液配方参考秦晓佳等的方法[

8 ] ,胁迫时间为1 2,

2 4,

3 6,

4 8和6 0d ,按胁 迫时间采集对应的马尾松幼苗,置于-8

0 ℃超低温冰箱中保存.

1 .

2 R N A提取与P mMY B

1 6 9全长克隆 所有试剂和容器均作无 R N a s e处理,容器用0 . 1% D E P C水浸泡过夜,高温高压灭菌. 按照艾德莱生 物公司 E A S Y s p i nP l u s植物 R NA 快速提取试剂盒中的步骤进行总 R NA 提取. 根据前期课题 组对低磷胁迫下马尾松转录组测序获得的MY B 基因EST序列片段MY B

1 6 9,共558b p ,在PrimerP r e m i e r 5中设计特异性克隆全长的巢式引物( 表1) ,按照S MA R TR A C E5 '

/

3 '

K i t中 步骤对 MY B

1 6 9基因进行3 '

和5 '

的巢式 P C R扩增. 目的片段经回收,连接到p R A C E载体上,再将载体 转入感受态细胞中,均匀涂于添加有 Am p抗生素的 L B平板上,

3 7 ℃培养过夜;

次日随机挑取单克隆 菌落,并用 M

1 3载体引物进行菌落 P C R验证,确认目的条带后送英骏公司进行测序. 表1 P mM Y B

1 6 9基因克隆所用引物列表 引物名称 引物序列(

5 '

t o3 '

) 引物名称 引物序列(

5 '

t o3 '

) PmMY B1

6 9 G S P

1 GGAGAGGAGAGG C AT T T GA C GAA C PmMY B1

6 9 NG S P

2 TA C C C T GT C GG C T C T T GT C AGT GGA PmMY B1

6 9 G S P

2 GA C T C AGAT T TAGAGGT TA C C GAGAT GG PmMY B1

6 9 - F AGAAT GAAT C C AAGGT GG C C C TA C T PmMY B1

6 9 NG S P

1 GA C GG C AGGAGT T GAG C AAAGGT T C PmMY B1

6 9 - R A C GT C A C ATAT GAT GAG C ATAT GAA

1 .

3 序列分析 利用 N C B I中在线软件 V e c S c r e e n ( h t t p : / / www . n c b i . n l m . n i h . g o v / t o o l s / v e c s c r e e n / ) 对序列的载体 与引物接头部分进行去除,用生物学软件 D NA S T A R 中Seqman对测序序列进行拼接,并使用在线软件 O R FF i n d e r ( h t t p : / / www . n c b i . n l m . n i h . g o v / g o r f / g o r f . h t m l ) 预测和分析其开放阅读框. 根据获得的全长 序列经 N C B I在线检索分别获得 PmMY B

1 6 9基因与其它植物的核酸和氨基酸序列的同源性,氨基酸序列 比对采用 C l u s t a l X 2软件,进化树构建用 ME GA 6;

利用在线软件 E x P A S y( h t t p : / / www .e x p a s y .o r g / ) 中ProtParam和ProtScale对获得的蛋白序列理化特性进行分析;

用SignalP

4 . 1S e r v e r ( h t t p : / / www . c b s .d t u .d k / s e r v i c e s / S i g n a l P / ) 对蛋白的信号肽进行预测;

用SOPMA( h t t p : / / m e t a d a t a b a s e .o r g / w i k i / S O PMA) 在线软件对蛋白二级结构进行预测;

用TMHMM( h t t p : / / www .c b s .d t u . d k / s e r v i c e s / TM - HMM / ) 在线软件对蛋白跨膜区域进行预测;