PDF《mMYB》

用WoLFPSORT( h t t p : / / www .g e n s c r i p t .c o m / w o l f - p s o r t . h t m l ) 在线软件进行亚细胞定位预测;

用SW I S S - MO D E L 数据库(http://www .s w i s s m o d e l .e x p a s y . o r g / ) 预测蛋白三维结构.

1 .

4 P mMY B

1 6 9时空表达分析 根据PmMY B

1 6 9基因序列,利用 P r i m e rP r e m i e r5软件设计相应的荧光定量和半定量引物,以前期 确定的适合的U B C 和G ADPH 作为荧光定量内参基因( 表2 ) . 以马尾松不同磷胁迫时期和不同组织的c D - NA 为模板,根据 P o w e r U p TM S Y B RG r e e nM a s t e rM i x提供的说明配制荧光定量 P C R 体系,用ABI公司 的CFXC o n n e c t TM R e a l - T i m eS y s t e m 进行荧光定量P C R 扩增. 重复3次,结果C t值根据L i v a k和S c h m i t - t g e n (

2 0

0 1 ) 2-Δ Δ C t 计算方法分析数据获得相对表达量. 表2 P mM Y B

1 6 9基因q P C R 所用引物列表 基因引物名称 引物序列(

5 '

t o3 '

) U B C U B C - F G A T T T A T T T C A T T G G C AG G C U B C - R AG G A T C A T C A G G A T T T G G G T G AD PH G A D P H - F A G GA GA G GA C C AA G A T AG G AA T GA D P H - R C C G C T G A T G GA G AAA T PmMY B

1 6

9 PmMY B

1 6

9 - q R T F TA C C C T G T C G G C T C T T G T PmMY B

1 6

9 - q R T R C T G G C T G C A T C G T C T T C T A T T

2 结果与分析

2 .

1 P mMY B

1 6 9全长克隆 通过 R A C E方法对已有的 MY B

1 6 9基因 E S T 序列进行扩增,设计巢式扩增引物 PmMY B

1 6

9 G S P

1、

2 西南大学学报( 自然科学版) h t t p : / / x b b j b . s w u . e d u . c n 第3 9卷PmMY B1

6 9 G S P

2、 PmMY B

1 6

9 NG S P1和PmMY B

1 6

9 NG S P2,经巢式P C R 扩增获得3 '

端序列约7

4 0b p ( 图1 A) ,

5 '

端序列约11

0 0b p ( 图1 B) ,拼接共获得全长14

0 7b p ;

利用 O R FF i n d e r对拼接的全长进行开 放阅读框预测,获得预测的开放阅读框大小为9

2 7b p ,非翻译区5 '

- UT R 为1

8 7b p ,非翻译区3 '

- UT R 为293b p ,编码308个氨基酸;

用PrimerP r e m i e r5 在开放阅读框两端设计引物PmMY B

1 6

9 - F 和PmMY B

1 6

9 - R,用以扩增基因c D NA 全长,通过测序验证表明所扩增得到的产物大小与预期片段大小相同 ( 图1 C) ,说明克隆PmMY B

1 6 9成功. A .3 '

- R A C E扩增, B .5 '

- R A C E扩增, C . O R FP C R 扩增. M . D L

2 0

0 0 M a r k e r , 1-3 . 依次为3 '

,

5 '

R A C E与完整 O R F扩增产物. 图1 P mM Y B

1 6 9基因 R A C EP C R 电泳图

2 .

2 P mMY B

1 6 9序列分析 利用 N C B I中Blast对PmMY B

1 6 9编码氨基酸进行同源性比对结果显示, PmMY B

1 6 9与北美云杉 ( P i c e as i t c h e n s i sA B R

1 6

4 6

7 . 1) 在MY B 保守结构域区域同源性最高,可达到8

7 .

8 8%,与杨树( P o p u l u s t r i c h o c a r p aX P_

0 0

2 3

1 4

5 1

5 . 1) 、大豆( G l y c i n em a xN P_0

0 1

2 3

5 8

6 5 . 1) 、番茄( S o l a n u ml y c o p e r s i c u m N P_

0 0

1 2

3 3

9 7

5 .

1 ) 、石榴( P u n i c ag r a n a t u m A J D

7 9

9 0

7 .

1 ) 等1 5种植物 MY B转录因子结构域同源性都在6

8 %~

7 3 %( 图2 ) ,说明马尾松PmMY B

1 6 9在MY B结构域上保守性较高,在进化过程中氨基酸的变化不大. 在PmMY B

1 6 9的保守结构域中,存在典型的螺旋 转角 螺旋( HTH) 结构,该结构可与 D NA 区域相结合,推 测可能具有转录调控作用. 右侧数字为 MY B保守结构域氨基酸个数. 图2 P mM Y B