PDF《快速参考手册》

快速参考手册 TaqMan? Copy Number Assays 简要操作手册 本操作说明提供了有关 TaqMan? Copy Number Assays 的简要操作指南.

更详细信息,请至赛默飞 世尔官方网站下载英文版说明书: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_062368.pdf 拷贝数变异是一类重要的 DNA 片段多态性,与多种疾病紧密相关.TaqMan? Copy Number Assays 用于定量检测人及小鼠基因组中拷贝数的变化情况. 一.产品性能 建议TaqMan? Copy Number Assays 搭配TaqPath? ProAmp? Master Mix 或TaqMan? Genotyping Master Mix 使用.在PCR 过程中同时需要加入 TaqMan? Copy Number Reference Assays.整个 PCR 所需组分为如下四种: ? 纯化后的基因组 DNA ? TaqMan? Copy Number Assays(有20*和60*两种规格) ? TaqMan? Copy Number Reference Assays(20*) ?

2 * Master Mix 二.产品组成 1. TaqMan? Copy Number Assays 含有: ? 一对特异性扩增靶基因片段的上下游引物 ? 一条带 FAM? 标记的 MGB 探针 2. TaqMan? Copy Number Reference Assays 含有: ? 一对特异性扩增 Reference 基因片段的上下游引物 ? 一条带 VIC?标记的淬灭基团为 TAMRA?的探针 TaqMan? Copy Number Assays 不再提供光盘文件,获取 assay 相关信息,请使用 Assay 的Sales Order #和Rack/Plate ID 至赛默飞世尔官网进行查询:https://www.thermofisher.com/order/taqman- files 三.产品储存 1. 储存: ? TaqMan? Copy Number Assays 和TaqMan? Copy Number Reference Assays 均需避 光储存于-15~ -25℃.避免过度暴露在光下,以免影响性能;

2 ? 尽量避免反复冻融,冻融次数需控制在

10 次以内;

若每次实验用量较少,建议分装以 减少冻融次数;

? 若订购的 TaqMan? Copy Number Assays 为60*规格,建议稀释到 20*工作液后分装并储存;

2. 稀释操作: 1) 用1*TE 缓冲液将 40*或80* TaqMan? Copy Number Assays 稀释至 20*工作液;

2) 将稀释后的工作液涡旋混匀,离心;

3) 将工作液分装后避光储存于-15~ -25℃;

1*TE 缓冲液配方:10mM Tris-HCl、1mM EDTA溶于无DNA酶的无菌过滤水(pH 8.0) 四.基因拷贝数定量检测实验流程 1. 实验设计: ? 实验中需包含待测样本、NTC(无模板对照)及参考样本(已知拷贝数的样本);

? 为保证数据可信,每个样本建议进行四次技术重复;

? 若使用 CopyCaller?Software 进行数据分析,为计算 confidence,每次实验需要包含至少

7 个拷贝数相同的样本. 2. 基因组 DNA 样本准备: ? 基因组 DNA 的提取和纯化请按照所选的提取方法进行操作;

? 基因组 DNA 定量:建议在基因分型实验前对基因组 DNA 进行定量.定量方式有紫外分光光 度法(A260/A280),NanoDrop? 或Qubit? 等;

? 基因组 DNA 加入量:根据实验体系,10 μL 实验体系加入

10 ng,20 μL 实验体系加入

20 ng. 每孔加入量需相同. 3. 反应混合液制备: 1) 根据所选的实验耗材,按如下表中单孔量来计算每个 Assay 中各组分最终需要量,注意各组 分的最终量还需要包含 10%-20%余量以避免移液损耗;

组分

384 孔板

96 孔板 2* Master Mix

5 μL

10 μL 20* TaqMan? Copy Number Assays 工作液 0.5 μL

1 μL 20* TaqMan? Copy Number Reference Assays 0.5 μL

1 μL 模板 参见样本准备说明 ddH2O 补足体系 最终体系

10 μL

20 μL

3 2) 2*Master Mix、20*TaqMan? Copy Number Assays 工作液和 20*TaqMan? Copy Number Reference Assays 使用前应充分混匀并离心,以保证液体都在管底;

3) 吸取所需量的 2*Master Mix、20*TaqMan? Copy Number Assays 工作液、20*TaqMan? Copy Number Reference Assays 和水到无菌反应管中,配成混合液,盖紧管盖,充分混匀 后离心以去除气泡;