PDF《ICS 11.020》

随后用无菌棉签 蘸取组织液接种于巧克力平板或血平板,三区划线后送至实验室进行培养. A.1.2 样品的运送 脑膜炎奈瑟菌对温度较为敏感,避免样品暴露于阳光、高温或寒冷的环境,温度过低或过高均可导 致病原菌死亡.在运送样品或培养物时,应保持样品处于25℃~35℃之间,不能低温运送(用于检测抗 体和核酸的样品除外). A.2 脑膜炎奈瑟菌培养及镜检 A.2.1 脑脊液样品培养 WS 295―2019

5 用灭菌的毛细管或微量移液器吸头吸取沉淀物直接接种于巧克力平板和 (或) 血平板,三区划线. 5% CO2环境,37℃,培养24 h~72 h,每日检查细菌生长情况,及时对平板上的疑似菌落进行转种和 鉴定. A.2.2 脑脊液样品镜检 吸取脑脊液样品离心后的沉淀物10 ?L~20 ?L,滴于载玻片上并涂开,在生物安全柜中风干玻片并 快速通过火焰3次以固定涂片,注意避免灼干.结晶紫染色1 min,用流动水冲洗玻片1 min,去除多余 水分;

革兰碘液媒染1 min,用流动水冲洗玻片并干燥;

95%乙醇脱色5 s~10 s;

用番红染液复染20 s~30 s,或用酚红复染10 s~15 s,流动水冲洗玻片并晾干或蘸干.显微镜观察染色的涂片,在亮视 野的透镜和油镜下,脑膜炎奈瑟菌位于多形核白细胞内或细胞外,为革兰阴性、肾形双球菌. A.2.3 血液样品分离培养 实验室接收到已接种血液样品的平板或血培养瓶后应立即置于37℃、 5% CO2的环境中,培养24 h~

72 h.如使用血培养瓶,每日观察细菌生长情况,如发现细菌生长,无菌操作取0.5 mL接种于巧克力平 板和(或)血平板. A.2.4 脑膜炎奈瑟菌菌落形态 脑膜炎奈瑟菌可在血平板或巧克力平板上生长.在血平板上培养18 h~20 h后,可见圆形、光滑、 湿润、中央凸起、边界清晰、灰色的菌落,不溶血,菌落直径达1 mm.在巧克力平板上生长的菌落呈 现大菌落、无色或灰色、不透明. A.2.5 脑膜炎奈瑟菌生化特征 采用氧化酶试验和糖代谢试验进行脑膜炎奈瑟菌的鉴定.如果氧化酶试验阳性,再进行糖代谢试 验.脑膜炎奈瑟菌能氧化葡萄糖和麦芽糖,但不氧化乳糖和蔗糖. A.3 脑膜炎奈瑟菌血清学分群 A.3.1 试验方法 通过血清玻片凝集法可对脑膜炎奈瑟菌进行血清群鉴定,目前脑膜炎奈瑟菌已经确定了12个不同 的血清群,其中,A、B、C、W、X和Y是最常见的引起流行性脑脊髓膜炎的6种血清群. A.3.2 实验操作 用乙醇擦净一块载玻片,用蜡笔或其它记号笔将载玻片分为多个部分,在每个部分的近底部处加

10 ?L灭菌生理盐水,用无菌接种环或针、涂棒或牙签从巧克力平板或血平板上挑取适量细菌培养物, 在生理盐水中将培养物制成略呈乳液状的悬液用于测试.在每个部分的上部加上所选的血清10 ?L或10 ?L生理盐水或PBS.在亮光下或黑色背景下,将血清或生理盐水与各自的菌悬液混合,摇动玻片1 min~2 min(时间可能因血清生产商不同而有所差异). 鉴于生物安全,WHO推荐使用福尔马林灭活的脑膜炎奈瑟菌悬液,而不是活菌的生理盐水悬液.福尔马林是一种致 癌物,在储存和使用时应高度小心,操作应在生物安全柜中进行. A.3.........