PDF《第4章 显微镜之构造、原理及使用》

物镜位於物体标本下方而 由下往上观察者为倒?光学显微镜.一般所观察的呈像方式为明视野,但 因所要观察物特性或欲呈像之?同,有特别的附属呈像系统,介绍如后. 图4-2. 上图由左至右:实体显微镜、正?光学显微镜、倒?光学显微镜. 1. 明视野(bright field):最基本的观察模式,主要是用?观察透或近乎 透明的材?(物体或生物标本).此种显微镜观察用的材?,除较简 单的低等生物(如细菌、真菌和大部分藻?等等)外,大都需用经过事 先的处?和?成薄片,制作成?时或永久?片后,才可以在显微镜下 观察.普通光学显微镜使用的光源可穿透标本,故常用於观察生物体 的器官组织结构或生物细胞的内部构造. 2.暗视野(dark field):可将要件架设於明视野显微镜之主体上,?用一 个?透光的?片遮掉聚光镜上大部分的光线,仅聚光镜边缘的光线可 以通过,结果使整个视野变暗,而标本物体的??变?,适合用於观 察小而薄、近乎透明或纤细的构造,如细菌或鞭毛或用於微小个体的 计?. 3. 相位差(phase contrast):可将要件架设於明视野显微镜之主体上,? 用光波通过标本物体时,速?会被减缓或加速而与通过封片介质之光 波产生 out of phase 的现象,造成光波互相干扰形成明暗对比,用以 观察透明无色的物体.此?显微镜之聚光镜有一phase ring,物镜内有 一phase plate(镜头外刻有Ph字样).当光线通过标本时光波?进速 ?受影响,而与其他光线产生约90?的out of phase,再?用物镜内之 phase plate加强干扰作用,使通过物体边缘的光加速,而与通过物体的 光成180?的out of phase,形成破坏性干扰(destructive interference) 使物体影像变暗,但具有明?之??. 4.微分干涉差(differential interference contrast, DIC;

Nomaski):可将要件 架设於明视野显微镜之主体上,原?与位相差显微镜?似,但可用於 观察较厚的标本,同时可观察到3-D影像.首先?用偏光镜将所有的 光波转成在同一平面(方向)振动,在?用?镜(beam splitter)将半 ?的光波转成90?,当光通过标本时,标本的化学结构会使某一方向 的光波波长较另一方向之光波短.在?用物镜(此?物镜外刻有DIC 字样)上方的?镜(beam analyzer)将光?回成束,造成光波波长差 ?形成干扰,使影像各部位呈现?同颜色,而使影像产生?体感. 图4-3. 上图由左至右:明视野、暗视野与相位差之成像比较,下图为 无(左)或有(右)?用微分干涉观察之结果. 5. 萤光(fluorescence):以波长较短的紫外光为光源,解像?较佳,同时 ?用紫外光射在萤光物质上会激发出可?光的特性,适合用於特定对 象之鉴别与定位.如以萤光物质(如calcofluor)或以抗体结合萤光物 质(如FITC),可用於标定特定对象在组织内的位置,此即萤光显微 镜技术.该设备昂贵、操作复杂、标本准备费时为其缺点,但结果的 高?专一性与准确性则非他种显微镜可取代. 明视野(左)及萤光处?(右)於显微镜之观察 ?用抗体结合萤光物质后,抗体会与特定标本细胞表面之抗原结合 (左),在萤光显微镜下即可观察到发出萤光的特定标本(右). 图4-4.萤光处?观察及免疫萤光处?观察.

(三)?射扫描共轭焦显微镜(Radial Scanning Confocal Microscopy) :共轭 焦显微镜所看到的影像只是一个极小的?点 , 而?是如传统显微镜所看到 的二维空间影像;

?用共轭焦显微镜内建的扫描器,可将影像由很多点组 成线,很多线组成面,取得由点厚?所组成的单一平面影像称为光?片 (optical sections).光?片配合电脑辅助运算处?,可呈现出兼具高解析? 和低背景杂讯的二维空间相片;