PDF《SHENTEK》

也可以在样本纯化 处理完成之后,用稀释液对纯化处理后的样本进行稀释, 然后再进行 DNA 残留检测.一般可考虑将高 DNA 含量样 本稀释

100 倍或

1000 倍.如果稀释了样本,则用稀释液作 为阴性对照. ? 若样本为干粉状态,可以用稀释液将干粉样本进行溶解, 再进行下一步操作;

或先用适当的试剂将干粉样本溶解, 配成高浓度溶液,再用稀释液稀释后,进行下一步操作. 一般可考虑将干粉样本稀释成 10mg/ml 或100mg/ml. ? pH 值要求:一般情况下生物制品纯化过程中间样本的 pH 值均为中性,若样本的 pH9,则会影响样本纯 化处理效果. 因此在样本处理前先测试一下样品 pH 值, 并 可以用 1M 的盐酸或氢氧化钠调整样本的 pH 至中性后 (pH 6.0~8.0)再进行纯化操作. ? 样本平行处理:为了确保结果的准确性,建议每个样品平 行进行三次 DNA 提取处理和检测. ? 阴性对照(NCS) :每次实验中都需要设置一个 NCS 作为 空白样本,NCS 与其他待测样本一起进行处理,以检验在 样本处理过程中是否存在交叉污染或环境污染. ? 加标回收(ERC) :用ERC 来评估 DNA 提取的效率、回收 率和准确度, 并可用 ERC 来评估验证分析方法和系统性能. 对具体样品的 DNA 加标量设定在其无加标测试值的 2-10 倍为宜. 版本: A/0 SHENTEK? 第6页共9页?样本消化 1. 每个待检测样本取 100μl 到1.5ml 干净的离心管中. 2. 每100μl 样品中加入 10μl 5M NaCl. 3. 加入蛋白酶 K 消化液振荡混匀后, 55℃水浴 1h. ? 提取准备 按照下述

96 深孔板排布预先加入相应溶液,其中: 第1或7列: 工作结合液 209.2μl/孔, 异丙醇 200μl/孔以及消 化后的全部样本 第2或8列:洗涤液 A 700μl/孔第3或9列:洗涤液 B 700μl/孔第4或10 列:磁珠 15μl/孔第5或11 列:洗脱液 100μl/孔 消化后的样本可在其他试剂全部加完后再加.样本体积最 大为 500μl/孔. 版本: A/0 SHENTEK? 第7页共9页第一组 第二组

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11 12 S1 S2 S1 ERC S3 S2 ERC S4 S3 ERC S5 S4 ERC S6 S5 ERC S6 ERC NCS PCS 结合液+异丙醇洗涤液A洗涤液B磁珠洗脱液/结合液+异丙醇洗涤液A洗涤液B磁珠洗脱液/样品 样品 ? 程序启动 1. 电源键打开――self-test―― 2. ―UV― ― 15min― . 此步骤可在提取准备操作之前进行 3. 将加好样的

96 深孔板放入仪器中固定位置, 并把塑料套管 版本: A/0 SHENTEK? 第8页共9页插入磁头对应位置. 4. Run―― ――rDNApurify―― ,仪器运行约 45min. 5. 程序结束,发出"滴滴"声,立即取出深孔板,将样本纯化 液全部转移到新的对应 EP 管内. 注意要点 ? 程序启动前,一定要加套管. ? 仪器工作前及完成后需要紫外灭菌至少

15 min,两次提取 间隔 30min 以上. ? 程序运行完毕后, 需立即将样本洗脱液转移至干净的 EP 管内. ? 请尽量在完成样本纯化处理当天进行后续的 DNA 检测, 以 保证检测结果的准确性. 版本: A/0 SHENTEK? 第9页共9页附表 常见问题 可能原因 解决方案 纯化回 收 率低 洗涤液 A 中未加入无水 乙醇. 按照说明书预先在洗涤液 A 中加入无 水乙醇并标记. 仪器所在空间温度较低. 将室温调节在

20 度以上. 磁珠贴壁. 将磁珠加入到深孔板底部中心. 样本盐离子浓度较低. 用5M 的NaCl 调节盐离子浓度. 样本 pH 值过低. 调整样本 pH 到中性范围. 样品蛋白含量高. 可相应增加蛋白酶 K 用量和消化时间. 回收结 果不稳 定 磁珠保存于-18℃及以下 导致磁珠性能下降. 在2~8℃保存磁珠. 加标不准确或洗脱液体 积吸取不准确. 定期校准移液枪,保证移液枪准确度;