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2 .

2 用pGE X一4 T一1 构建汉 滩病毒 G1 和G2表达质粒 利用 E c o R I 和Salt两个酶切位 点. 将G1 和G2编码区基困 克隆到 质粒 p G E X一4 T一1中构建 表达质粒 . 详 细构建过程 见示意图

2 .通过 此方 法构建的表达质粒表选 的融合蛋 白中, Gl 和G2的 开放读码框 最有发 生改变.构建 的表达质垃 用酶 切方法鉴定 . G1蕾t五C6 d i n g g e n e 图1质粒 p K7

6 G 1和pK76G2构 建过程 示意 图Fi g

1 C o n s r z u~i o u

0 f e x p r e s s e d p l e s ml d p K7

6 C -

1 o ad p K~f G2 图2质粒 p T

7 6 G1和p16(32构建 过程 示意 圈Fi g

1 Co n s t r u c t i o n

0 f p d pT7

6 G1 o ad p T7

6 G2

2 3 用pGEX一4 T一1 构建G1和 G 2部分编码 基因的表达质粒 由于表达载体 p G E X一4 T一1上多克隆酵切位点之后有两个可利用的终止密码子. 故利用其构建 G

1 和G2 部分 M 编码 基饲 的表达质粒.

2 .

3 1 G1部分编码 区基困表选 质粒 的构 建G1 编码 区基因上有 一十 C a a I 酶 切位点, 切 点位 于1274位棱苷酸. 质粒pGEX一4 T一1中无此酶切位点 . 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒.学 第t2卷故选用 C l a I 和MI酶切缺失 G 1教基末端 的部 分棱秘序列 . 袖建表选 G 1氨基束端

4 2

1 十氨 基酸残基多破 的 表达质粒.用EcoRI和SalI共同爵切质粒 p T '

/

6 G

1 . 回收大片段( 约6.2kb大小) . 以Klenow片嚣补平奠切位 点的粘性 末端 后.用T4DNA连接 爵加 以连接 .构建过 程详 见示 意图23.用瓠接加l 以鉴定 .鞠建 的表 达 质粒 利用了载体 质粒的终止 密码子. 防止 了通读现象发 生.

2 .

3 .

2 G 2部分编码 区基 因表 达质粒的构建 . 同样利 用oGEX一4 T一1构建 G 2部分编码 区基 因的表 达质粒 . 为了利 用表选 羲体 上的终 止密码子 . 采 用下述方 法构建表达 G2 氨基 末端

2 2 2十戴基酸 残基的多肽表选质 粒经EcoRI 和SalI共同爵 切的 表达 载体oGEX一4 T一1回收 后备用.用Em, qI 和BstEII共屙爵 切厦 粒pT76G2.回收约

0 .

6 5 k b 太小的 晓 氰基末端编码区基因.用T4DNA连接爵连接上述 回收的校酸l 芹段, 连接 后用Kl e n o w片段 将不 匹配的 M I I 和SalI酶切位 点的 粘性 末端补 平. 补平 后再 用T4 D N A连 接爵 加以连 接.详细 构建过程 觅示意图

2 ~4 , 同样 用酶切方祛加 以鉴定 . 盆¨. J 一1.2萼|-iIdG I c n g g l i n t 圈3质粒 p T

7 6 GI 一1 的梅建示 意田 F

3 C . ~mt r u c t i o n

0 f 曙跣d p l m mi d p T7

6 GI一1 O

6 5 k b b o f G2 咖* 田4质粒 p 丌6G2―1 梅建的示意圈 F i g

4 C嘶毗n _ 岫afe坤fe・edolmmaJdpT7

6 G

2 ―

1 表达载体 o K K

2 2 3―3和oGEX一4 T一1启动子 T a e都需 用1Fr G诱导表达, I t '

T G的终浓度均为

1 珊n k

2 .

4 用表达 的Gl和 G 2及G1 和G2氰基末端多肚免疫 小鼠. 用诱导表达的细菌免疫小鼠, 免痉方法同参考文献n l .用莉接受光汝检穗免疫小鼠血 滑中抗汉滩病毒 抗体 的漓度 . 结果.1衰达质粒的将蔓 目的质粒的酶切鉴定结果见图

5 ~8 . 用pKK223―3 构建的 Gl 和G2表达质粒分别命 名为 p K

7 6 C - ~ 和pKT(~G'

2.用 p G F . X一4T一1扮悫的G I 和G2完整鞠 鹦嚣 善因的 蓑 达质 粒分 _ 蜀昔龠名 夤6Gi和:~rn.mo { 孽 建的 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 黄 长形 等:用不同载体在太 睹杆 菌中表达投滩病毒 囊膜糖蛋 白G1 和G2325G1和 G 2缺 失基 因的 表达 质粒命 名为pT76G1 ―1和pT76G2一l . 图5质粒pK76G2限制性 内切酵 分析 Fi g