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2 条单链 oligo 序列;

PCR 双gRNA 克隆框并 BbsI 酶切. 将双 gRNA 克隆框克隆入敲 除载体中. 转化大肠杆菌细胞;

筛选阳性 克隆;

测序验证序列;

质粒大 提;

电转染靶细胞. 在细胞内 crRNA 识别靶位点, Cas9 对靶位点进行随机剪切. Cruiser? 酶切细胞池, 计算突变率;

Cruiser? 酶切初筛阳性克隆;

将阳 性克隆测序验证;

TA 克隆,做敲 除序列比对分析.

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5 Genloci pGK2.2(EGFP+Puror ) vector Protocol No. PT161215-3 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 5/10 IV. 操作步骤 实验前,请您务必做好以下验证实验: A.单细胞生长情况,确保单个细胞可以正常生长形成单克隆,即,低密度的细胞在培养皿中可以 形成单克隆. B.目的基因的表达情况分析,为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失,首先需要 PCR 扩增 靶基因,并对 PCR 结果进行测序,确保靶基因的完整存在;

其次,您还可以用 RT-PCR 分析 靶基因的活跃度. 1. 设计 Oligo DNA 序列 首先, 您需要在靶标 DNA 区域中设计一对 oligo DNA, 敲除位点的选择您可以通过以下在线工具选择: 麻省理工学院的 CRISPR Design:http://crispr.mit.edu/ 德国癌症研究中心的 E-Crisp:www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html 根据您选择好的两个 Guide 序列(20bp 左右) ,按下列原则设计您的引物. Primer-F:5'

_GAGAAGACGGAAAC-(20bp 靶位点反向+T)-CCTAGATCTGTGGTCTCATAC_3'

Primer-R:5'

_GAGAAGACGGAAAC-(20bp 靶位点反向+C)-CCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC_3'

注意:a.GAAGAC 为BbsI 酶切位点 b.由于 H1 promoter 的转录起始位点为 A,如果你选取的 Guide 序列的第一个碱基不是 A,应在设计上游引物时加上一个 T,见上方红色 加粗字体,但有研究表明:将H1 启动子的+1 位腺苷酸更换为尿苷酸、胞苷酸、鸟苷酸,似乎并不影响启动子的转录活性. c. 由于 U6 promoter 的转录起始位点为 G,如果你选取的 Guide 序列的第一个碱基不是 G,应自行加一个 G 上去,见上方红色加粗字体. 下面我们选择麻省理工学院的 CRISPR Design 工具来做设计举例,以human Fut8 基因为例,一次只 能输入大小为 23~250bp 的基因片段,最好一次只输入一个外显子,避免 Guide 序列跨内含子的. 点击 Download as genbank 按钮,出现以下界面: 根据左边的 score 的高低选取合适的 Guide 序列,score 的高低并不代表敲除效率的高低, 所以为提高 敲除的成功率,一般选择 3~5 个Guide 序列,先构建 3~5 个单敲除载体.后续先在 pool 细胞的基础上验 证出有效的位点,再拿有效的两个位点构建双敲载体,做正式电转,筛选单克隆.以Guide#1 和Guide#2 序列为例(Guide#1:AATGAGCATAATCCAACGCC AGG、 Guide#2:CATGGACTGGTTCCTGGCGT TGG), Genloci pGK2.2(EGFP+Puror ) vector Protocol No. PT161215-3 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 6/10

2 条单链 oligo 的序列如下: Primer-F: 5'

-GAGAAGACGGAAACGGCGTTGGATTATGCTCATTCCTAGATCTGTGGTCTCATAC-3'

Primer-R : 5'

-GAGAAGACGGAAACACGCCAGGAACCAGTCCATGCCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3'

另外,您需要在敲除位点上下游各设计一条引物,用于后续 PCR 或测序检测阳性克隆,引物能扩增约 300~500bp 的DNA 片段,上下游引物距突变位点约 100~400bp.将设计后的序列送到值得信赖的公司 合成,纯化级别为 PAGE. 2. pGK2.2(EGFP+Puror ) vector 线性化处理 BbsI 或BpiI 酶切 pGK2.0(Neor ) vector,胶回收约 10kb 多的条带,约600bp 的条带无需回收. 3. 获得双 gRNA 克隆框 在灭菌 PCR 管中配制如下反应体系: PCR 反应程序推荐如下: 4. 片段的胶回........