PDF《第27 号标准：诊断规程 DP 6:》

1 min,用无菌蒸馏水冲洗三次并粉碎.取少量提取 物在营养培养基上划线.适宜的分离培养基是加入0.1% 葡萄糖的营养琼脂(NGA)、酵母蛋白胨葡萄糖琼脂(YPGA)(酵母提取液,5g;

Bacto 蛋白胨, 5g;

葡萄糖,10g;

琼脂,20g;

蒸馏水,1 l;

pH7.0)和Wakimoto 培养基(马铃薯 肉汤,250ml;

蔗糖,15g;

蛋白胨,5g;

Na2HPO4.12H2O,0.8 g;

Ca(NO3)2・7 H2O,0.5 g;

Bacto?琼脂,20g;

蒸馏水,1 l;

pH7.2).必要时,可在培养基高压 灭菌后加入过滤灭菌后的放线菌酮(100 mg/l)作为杀菌剂. 菌落在三种培养基上都呈圆形、凸出且边缘光滑,粘质,乳黄色.在25C28 ?C 下培养

3 至5天后对生长进行评估.在商品果样品中,细菌可能因受挤压而不易培 养;

因此,可能需要更长的培养时间,或者按照 3.1.6.2.节所述,用生测方法从样品 中提取细菌.在培养基中加入春雷霉素和头孢菌素(半选择性 KC 或KCB 培养基) 会抑制几种腐生细菌,从而有利于病原菌的分离(Graham 等,1989;

Pruvost 等, 2005). 在本诊断规程中,各种方法(包括引用的商品名)的描述和发表时一样,因为 它们决定了最初所获得的灵敏度、特异性和可重复性.化学药品名称(例如商标 名)的使用并不意味着对它们的认可,而排斥可能同样适用的其他产品.本规程提 供的实验室程序可根据各个实验室的标准进行调整,只要它们经过了充分的验证. 3.1.3 血清学检测:间接免疫荧光法 对血清学检测(IF 和酶联免疫吸附分析)而言,适当的对照对确保检测结果可 靠至关重要.每个检测都应包括一个阳性和阴性对照.阳性对照可包括将一个柑橘 限定有害生物诊断规程 DP 6:2014 《国际植物保护公约》 DP 6-5 溃疡病菌参考菌株重新悬浮到健康寄主植物提取物中(用于植物材料的检测)或磷 酸缓冲液(PBS)中(用于细菌培养物的鉴定).阴性对照应包括健康寄主植物提 取物(用于植物材料的检测)或非目标细菌种类的悬浮物(用于细菌培养物的鉴 定). 对细菌细胞的血清学检测而言,从平板上取一菌环新鲜培养物,重新悬浮在

1 ml PBS(NaCl,8 g;

KCl,0.2 g;

Na2HPO4・12H2O,2.9 g;

KH2PO4,0.2 g;

加 蒸馏水至

1 l;

pH 7.2),制备约

108 克隆形成单位(cfu)/ml (EPPO,2009). 对植物组织的血清学检测而言,应选择有症状的样品 C 带有坏死病变的嫩梢、 幼枝、叶片和果实,或幼枝、枝条、树干上溃疡部位的组织.样品应按照建议用于 所采用的特定血清学检测方法的通用程序处理.一般而言,植物组织在用于血清学 检测前应在新制备的抗氧化剂浸软缓冲液(聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-10,20 g;

甘露 醇,10 g;

抗坏血酸,1.76 g;

还原型谷胱甘肽,3 g;

PBS,10 mM,1 l;

pH 7.2) 或PBS(NaCl,8 g;

KCl,0.2 g;

Na2HPO4・12H2O,2.9 g;

KH2PO4,0.2 g;

加蒸 馏水至

1 l;

pH 7.2)中研磨.两种溶液都使用无菌的 0.22 ?m 薄膜进行过滤灭菌. 用移液管取待检测的每种细菌制备液或植物样品

25 ?l,加入用塑料膜包被的 多窗口显微镜载玻片上,在空气中干燥后在火苗上稍微加热固定.每一种待检测的 细菌或样品使用单独的玻片,用于 ELISA 检测的阳性和阴性对照同样如此.用PBS (pH 7.2)稀释购买到的抗血清或单克隆抗体,取25 ?l 适当的稀释液,加入每片玻 片的各个窗口中.阴性对照可包含同样稀释倍数的正常(未免疫)血清和 PBS.玻 片室温下在保湿箱中培养